EB 病毒感染繼發噬血細胞綜合征患兒外周血T淋巴細胞亞群及細胞因子水平變化

陳開瀾，楊李，宋娜，吳彬，李暉

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院血液腫瘤科，武漢 430016

噬血細胞淋巴組織細胞增生癥（HLH）是由過度活化的淋巴組織細胞無效增生導致的高炎癥反應，其產生的細胞因子風暴常引起持續發熱、肝脾腫大、多器官功能障礙、血細胞進行性下降、組織細胞吞噬血細胞等現象。HLH 在兒童和嬰幼兒高發，起病急，病情進展迅速，病死率高［1］。HLH 分為原發性HLH 和繼發性HLH，兒童繼發性HLH 原因主要是感染，特別以EB 病毒（EBV）感染最常見。按照國際組織細胞協會推薦的HLH-1994 方案給予激素聯合依托泊苷治療雖然可控制HLH 的高炎癥反應，但對EBV 無清除作用，特別是對感染T 淋巴細胞和NK 細胞的EBV 清除無能，往往會導致疾病復燃惡化［2-3］。其他慢病毒諸如乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒及某些腫瘤中均存在的T 細胞功能耗竭，即在慢病毒感染及腫瘤負荷的機體中T 淋巴細胞在持續抗原刺激下功能異常狀態，主要是抑制性受體表達，分泌細胞因子能力以及穿孔素、顆粒酶的殺傷功能減退，T 淋巴細胞自我更新及增殖能力降低等一系列功能耗竭表現［4-5］。EB 病毒感染后的HLH 可能同樣存在這種T 淋巴細胞耗竭而導致T淋巴細胞不能清除感染細胞。本研究對EBV 感染繼發噬血細胞綜合征（EBV-HLH）患兒的T 淋巴細胞亞群和細胞因子水平進行分析，探討T 細胞功能耗竭在EBV 感染的HLH 中發揮的作用，為臨床診治提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 EBV 感染確診標準：實驗室檢查抗EB 病毒VCA-IgM 和抗EBV-VCA-IgG 抗體陽性，或實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測EBV-DNA陽性，滿足以上任一種情況即可確診。HLH 的診斷根據國際組織細胞協會HLH 2004 診斷標準（以下 8 條至少滿足 5 條）［3］：①發熱；②全血細胞減少（三系中至少兩系減少）：血紅蛋白＜90 g/L、血小板＜100×109/L 或中性粒細胞＜1×109/L；③脾腫大（肋下≥3 cm）；④低纖維蛋白原血癥和（或）高甘油三酯血癥：纖維蛋白原≤1.5 g/L，甘油三酯≥3 mmol/L；⑤骨髓或淋巴結形態學涂片發現吞噬細胞存在，無惡性腫瘤證據；⑥可溶性CD25≥2 400 U/mL；⑦NK 細胞活性減低或缺乏；⑧鐵蛋白≥500μg/L。選取 2019 年 2 月—2021 年 11 月我院收治的EBV-HLH 患兒23例，男15例、女8例，年齡1.6～14 歲、中位年齡5.6 歲，外周血免疫球蛋白IgG（9.9 ± 2.9）g/L，EBV-DNA 載量 2 480（87，7 030）×103copies/mL；另選擇同期收治的EBV 感染相關傳染性單核細胞增多癥（IM）患兒29 例作為對照組，男 22 例、女 7 例，年齡 1.8～13 歲、中位年齡3.9 歲，外周血免疫球蛋白IgG（11.08 ± 3.25）g/L，EBV-DNA 載 量 937（176，2 210）×103copies/mL。兩組性別、年齡、外周血免疫球蛋白水平及EBVDNA 載量具有可比性。

1.2 外周血T 淋巴細胞亞群檢測 使用EDTA 抗凝管采集患兒靜脈血2 mL，24 h內上BD 公司FACSCantoⅡ流式細胞儀檢測。取100 μL 血加入PECD3、FITC-CD57、PE-Cy7-CD4、Apc-CD279（PD1）、V450-CD69、V500-CD45、Apc-Cy7-CD8 各 20 μL，同時設同型對照管。混勻后4 ℃避光孵育30 min，離心、洗滌、棄上清液，加入0.5 mL 預冷的PBS 重懸細胞，上流式細胞儀分別檢測CD3（+總T 淋巴細胞）及CD4+CD3（+調節性T 淋巴細胞）、CD8+CD3（+殺傷性T淋巴細胞）亞群中的PD1+細胞（程序化死亡受體）、CD57+細胞（終末衰老T細胞）、CD69+活化細胞（刺激后活化的T細胞）比例。每管獲取10 000個細胞，結果以百分率表示。

1.3 外周血T 淋巴細胞因子水平檢測 采集患兒EDTA 抗凝的靜脈血2 mL，應用BD 公司FACSCantoⅡ流式細胞儀和江西諾德醫療器械有限公司試劑盒，將捕獲微球混合液（包含抗人IL-2 單抗、抗IL-4單抗、抗 IL-6 單抗、抗 IL-10 單抗、抗 TNF-α 單抗、抗IFN-γ 單抗）低速離心 2 000 r/min 離心 5 min，吸去上清，加入與所吸走上清等體積的微球緩沖液，渦旋充分混勻后，避光孵育30 min。每個實驗管中加25 μL 孵育后的捕獲微球混勻液，標準管加入25μL梯度稀釋好的標準品，樣本管加入25μL 待測血漿。所有實驗管加25 μL 熒光抗體檢測試劑，室溫孵育2.5 h，加入 PBS 緩沖液，離心棄上清，加入 100 μL PBS 緩沖液，上機進行熒光檢測 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。采用Shapirowilk 檢驗和Q-Q圖方法進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組T 淋巴細胞亞群比較 EBV-HLH 組活化的CD69+CD3+T 淋巴細胞比例高于EBV-IM 組，PD1+CD3+T 淋 巴 細 胞 比 例 低 于 EBV-IM 組（P＜0.05），兩組CD57+CD3+T 淋巴細胞比例無統計學差異（P＞0.05），見表1。進一步比較顯示，EBV-HLH組CD69+CD3+T 淋巴細胞主要以CD69+CD8+CD3+T淋巴細胞增高為主（P＜0.05），而CD69+CD4+CD3+T淋巴細胞增高不明顯（P＞0.05）；PD1+CD3+T 淋巴細胞主要以PD1+CD8+CD3+T 淋巴細胞減少為主（P＜0.05），而PD1+CD4+CD3+T淋巴細胞減少不明顯（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組CD3+T淋巴細胞中CD57+、CD69+及PD1+細胞比例比較［%，M（P25，P75）］

表2 兩組CD4+CD3+及CD8+CD3+T淋巴細胞亞群中CD69+和PD1+細胞比例比較［%，（P25，P75）］

2.2 兩組外周血細胞因子水平比較 見表3。

表3 兩組外周血細胞因子水平比較［ng/L，M（P25，P75）］

3 討論

目前，HLH 的治療主要采用國際組織細胞協會的HLH-94/2004方案，包括地塞米松、依托泊苷等藥物，治療目標是抑制組織細胞/巨噬細胞過度激活和增殖導致的細胞因子風暴［6］。理想的EBV-HLH治療不僅要控制細胞因子風暴，同時還要修復受損的免疫細胞功能，從而最終清除EBV感染細胞，達到從根本上治愈疾病。EBV-IM為原發性EBV感染，病毒多在B淋巴細胞內復制，殺傷性T淋巴細胞（CTLs）則負責清除感染的B 淋巴細胞，同時產生記憶細胞。而EBV-HLH的發病機制與IM不同，EBV多感染T淋巴細胞或NK 細胞，CTLs 清除病毒感染的細胞能力下降，被感染的細胞出現克隆增殖，引起持續性無效的T淋巴細胞和巨噬細胞激活，導致細胞因子大量釋放和級聯反應，從而形成噬血細胞綜合征［7-8］。本研究結果顯示，EBV-HLH 組 CD69+CD3+的活化 T 淋巴細胞比例高于EBV-IM 組，提示EBV-HLH 確實激活了更多的活化T 淋巴細胞進入血液，且主要激活的是CD69+活化細胞。EBV-HLH的發生與EBV感染負荷無明顯相關性，表現為EBV-HLH 組與EBV-IM 組的病毒載量無明顯差異。已有研究表明，細胞免疫而非體液免疫在EBV-HLH發揮主導作用，恢復受損的細胞免疫功能才能從根本上治愈EBV-HLH［9-10］。本研究中也顯示，兩組患兒外周血IgG、IgM等體液免疫的球蛋白水平接近，無明顯差異。

T 細胞功能耗竭主要表現為細胞增殖能力下降、細胞毒作用減低甚至喪失、分泌細胞因子能力降低。細胞功能丟失按等級依次出現，首先丟失的是細胞毒性、增殖能力和IL-2產生能力，隨后丟失的是TNF-α 產生能力，嚴重的耗竭則出現病毒特異性細胞部分或完全喪失細胞毒脫顆粒的能力，最終導致病毒特異性T 淋巴細胞凋亡［11-12］。既往研究認為，CD57、KLRG1 和PD1 均與細胞的復制性衰老相關，表達這些標志物的細胞增殖能力較弱，生長停滯，自我更新減退，喪失分化能力，對增殖刺激反應差［13］。但PD1 和CD57 并不總是同時表達，特別是終末分化效應記憶細胞（TEMRA）群會表達更高的CD57 和KLRG1但不表達PD1，而效應記憶性細胞（CD28-CD 45RA-）通常高表達PD1但卻無CD57，這種差異性表達可能代表細胞從高增殖/低細胞毒性功能轉換為低增殖/高細胞毒性［14］。終末效應細胞 TEMRA 有高水平的CD57 表達與復制性衰老有關，而程序化死亡受體PD1表達在效應記憶細胞與免疫細胞的耗竭有關。本研究結果顯示，EBV-HLH 組與EBV-IM組CD57+CD3+T 淋巴細胞比例無明顯差異，而PD1+CD3+T 淋巴細胞 EBV-HLH 組較 EBV-IM 組明顯減少，說明這種代表復制性衰老的終末效應細胞在兩組間無明顯區別，而代表低增殖高細胞毒性的PD1+CD3+T 淋巴細胞在EBV-HLH 組明顯減少。提示效應功能的T淋巴細胞減少而不是凋亡衰老導致EBV-HLH 發生。特別是在EBV-HLH 組中，以PD1+CD8+CD3+T 淋巴細胞減少為主而非PD1+CD4+CD3+T 淋巴細胞減少，也表明是T 淋巴細胞殺傷功能受損而非調節功能受損導致EBV-HLH，即EBVHLH中T淋巴細胞的耗竭主要表現在PD1+CD8+CD3+T淋巴細胞的耗竭。這為PD-1和PD-L1等程序化死亡受體相關因子在EBV-HLH 中的應用提供了部分依據。ROBERTS 等［15］在外周血單個核細胞培養體系中用PD1 特異性抗體pembrolizumab 阻斷PD1/PDL1相互作用，可恢復PD1+T淋巴細胞的分泌細胞因子功能，表明免疫耗竭是可逆的。LIU 等［16］在EBV-HLH 患者中應用 PD1 抑制劑 Nivolumab，提高了PD-1、LAG-3表達的細胞毒性T淋巴細胞亞群，增強了T 淋巴細胞清除EBV 感染細胞的能力，同時控制了HLH的發展。

IL-2和IFN-γ促進T淋巴細胞終末分化與擴增，大量的靜止T細胞轉化為效應T細胞，而IL-10抑制T淋巴細胞增殖。IL-2由Th1細胞產生，使靜止T淋巴細胞轉化為活化T淋巴細胞，促進T淋巴細胞增殖及分化，IL-2增強CTLs、NK細胞殺傷活性及誘導IFN-γ產生［8］。IFN-γ 可以促進 T 淋巴細胞的增殖與分化，從而促使T淋巴細胞活化為效應細胞。活化的效應T淋巴細胞和巨噬細胞釋放大量細胞因子，持續刺激T淋巴細胞和巨噬細胞不受控制的增殖，導致大量終末分化階段的T淋巴細胞產生，T淋巴細胞一方面被耗竭，一方面其正常的殺傷功能減弱［14，17］。IL-10 高表達具有免疫抑制作用，抑制人IL-2分泌，抑制Th細胞分化及T淋巴細胞增殖［8］。本研究結果顯示，EBVHLH組IL-2、IFN-γ水平較EBV-IM組升高，這兩種細胞因子持續刺激可能導致T淋巴細胞大量進入終末分化階段（持續被耗竭）而減弱其細胞毒殺傷作用；同時抑制性細胞因子IL-10 在EBV-HLH 組較EBVIM 組升高，抑制了正常T 淋巴細胞增殖。本研究與既往湯永民等［19］報道的HLH患兒Th1/Th2細胞因子譜表達差異相符，也一定程度上說明EBV-HLH中受損的細胞免疫功能可能由于T淋巴細胞耗竭導致。

總之，本研究支持在EBV-HLH 中存在以T 細胞功能耗竭為主的疾病發展機制，提示程序化死亡因子及其受體拮抗劑在EBV-HLH 應用具有一定臨床意義。進一步研究需要通過單細胞功能測序探討耗竭T淋巴細胞的具體亞型對免疫檢查點拮抗劑具有最佳響應，從而依據其表型篩選出更適合應用免疫檢查點抑制劑患者。