基于生物信息學方法對胰腺癌發生發展關鍵基因的篩選

陳科 ，洪瀟 ，馮彥超 ，應偉 ，李文菠 ，李釗 ，趙敬兵 ，汪杰 ，周國俊 ，冷政偉

1 川北醫學院附屬醫院肝膽外科，四川南充 637000；2 川北醫學院附屬醫院腫瘤干細胞研究中心

胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，惡性程度極高，5 年總生存率不足8%［1］。胰腺癌起病隱匿，早期發現率極低，確診時多處于中晚期進展階段，失去根治性手術機會。目前全世界胰腺癌的診治現狀不容樂觀，手術聯合輔助化療是目前可切除胰腺癌的最有效的治療手段，但僅有20%的患者可行手術治療，術后易復發和轉移，根治性手術后的患者5 年生存率也僅為25%［2-3］。迄今，胰腺癌的病因和確切的分子機制尚不清楚，可能涉及多個基因的表達異常。因此，尋找胰腺癌的關鍵基因對于確立早期診斷、預后標志物和治療新靶點至關重要。近年來，隨著高通量技術的發展，基因芯片和基因測序的運用已成為研究腫瘤疾病必要且高效的方法。如今各大數據庫中擁有豐富的基因檢測和分析結果，但缺少精確、有效的數據挖掘。本研究利用生物信息學方法對胰腺癌與癌旁正常組織進行差異表達基因篩選并深入分析，旨在為胰腺癌尋找到特異的腫瘤分子標志物和藥物治療靶點。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據信息來源 從NCBI-GEO數據庫（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo）中下載3 個胰腺癌芯片，即GSE71989、GSE62165、GSE62165，分別包含胰腺癌組織13、118、15例，癌旁組織8、13、7例。

1.2 胰腺癌與癌旁組織差異表達基因及共表達差異基因的篩選 通過GEO2R在線工具，以｜logFC｜＞2 且校正P＜0.05 的基因為差異表達基因，其中logFC＞2 為上調，logFC＜-2 為下調，定義胰腺癌與癌旁組織中的差異表達基因。通過韋恩在線網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）繪制韋恩圖，獲得3 個基因芯片共有的差異表達基因。

1.3 胰腺癌與癌旁組織核心差異表達基因的篩選將所獲得的共有差異表達基因用STRING 網站（https：//string-db. org）構建蛋白—蛋白相互作用網絡（PPI）網絡圖，利用Cytoscape3.7.2軟件及MCODE插件分析PPI網絡圖，獲得PPI中聯系最為緊密的核心網絡，將這核心網絡中的基因定義為核心差異表達基因。MCODE 分析設置條件：度數截斷值=2，節點分數截斷值=0.2，K-分數=2，最大深度=100。

1.4 核心差異表達基因不同表達量胰腺癌患者的生存情況分析 在GEPIA 網站（http：//gepia. cancer-pku.cn）中，對核心差異表達基因分別進行生存分析，選擇總生存期（OS）為指標，癌癥名稱選擇胰腺癌，描繪核心差異表達基因高表達與低表達患者的生存曲線圖，篩選出生存分析中P＜0.05 的基因，作為胰腺癌預后相關基因。

1.5 預后核心差異表達基因在胰腺癌與癌旁組織中的表達分析 在GEPIA 網站中，利用Box Plots 分析胰腺癌與癌旁組織中相關基因的表達量，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 個基因芯片共表達差異基因篩選結果 從3 個基因芯片 GSE71989、GSE62165、GSE19650 中分別篩選出1 085、1 598、3 426 個差異表達基因，其中上調 887、1 140、728 個，下調198、458、2 698 個。通過韋恩圖分析，獲得3 個基因芯片共表達差異基因156個，其中上調62個、下調94個。見圖1。

圖1 3個芯片差異表達基因的韋恩圖

2.2 胰腺癌與癌旁組織核心差異表達基因的篩選結果 將156 個差異表達基因提交至STRING 在線網站后，共有152 個基因出現在PPI 網絡中，其中節點數 152 個，邊數 291 條，聚類系數 0.447，見 OSID碼圖1。將得到的PPI 使用Cytoscape3.7.2 軟件及MCODE 插件分析后，得到2 個相交點最多的基因簇；將這2 個基因簇涉及的差異表達基因定義為核心差異表達基因，共得到19 個核心差異表達基因，其中上調基因6個，即ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP1、RRM2、TOP2A，下調基因 13 個，即 CPA1、CTRL、CLPS、CTRC、CPA2、CEL、CELA2B、PLA2G1B、PNLIPRP1、PNLIP、CELA3A、SYCN、CPB1。

2.3 核心差異表達基因不同表達量胰腺癌患者的OS 比較 使用GEPIA 在線網站對19 個核心差異表達基因不同表達量患者的OS 進行比較，結果顯示，ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP1、RRM2、TOP2A 基因在高表達患者的OS 低于低表達患者（P均＜0.05），見OSID 碼圖2。其余13 個基因不同表達量患者的OS比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

2.4 胰腺癌與癌旁組織核心差異表達基因的表達量比較 在GEPIA 網站中利用Box Plots 對上述6 個與預后相關的基因進行表達量驗證，結果顯示6 個基因在胰腺癌中的表達量均高于癌旁組織（P均＜0.05）。見OSID碼圖3。

3 討論

胰腺癌的發生發展涉及基因、環境、飲食等多種因素的共同作用過程，利用生物信息學技術準確篩選出導致胰腺癌發生發展的關鍵基因，能夠為胰腺癌的早期診斷和精準靶向治療提供重要依據。基因芯片是指利用現代探針固相原位合成技術、照相平板印刷技術、高分子合成技術等微電子技術把大量分子生物學技術具體而微的固定在一定狹小的空間內，以實現高速度、高通量、集約化和低成本的分析技術。本研究基于生物信息學分析，在GEO 數據庫中篩選出近幾年樣本量較大的3份胰腺癌與癌旁組織基因芯片，在多個生物信息分析網站中進行系統全面的分析，最終得出ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP、RRM2、TOP2A 基因與胰腺癌的發生發展有重要關系。

ANLN 是一種肌動蛋白結合蛋白，在胞質分裂中起重要作用。在乳腺癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、子宮內膜癌和胰腺癌中，ANLN 上調可影響細胞的增殖、遷移和浸潤，進而導致腫瘤的進展［4-5］。研究顯示，ANLN 表達水平與腫瘤的轉移潛能有關，可能是因為ANLN 可以通過細胞骨架重塑促進上皮間充質轉化（EMT）和細胞遷移，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移［6］。WANG等［7］研究認為，ANLN在胰腺癌高表達可能與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、遠處轉移和預后不良有關，ANLN 可誘導 EZH2 上調，通過 miR-218-5p/LASP1信號軸促進胰腺癌發生發展。

CDK1 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在調節細胞周期、DNA 復制和分離的進程中發揮著關鍵作用。VASSILEV 等［8］報道，使用 CDK 抑制劑誘導的G2期阻滯可阻止DNA 雙鏈斷裂的細胞轉變為M期，認為CDK1 是一種與腫瘤生長相關的細胞周期調 節 劑 。 ZHANG 等［9］研 究 發 現 ，CDK1 是 BRAF V600E 結直腸癌中細胞凋亡抗性的新介質，其與MEK/ERK 抑制劑聯合是一種有效的臨床治療策略。HUANG 等［10］利用 CDK 抑制劑阻斷細胞因子干擾素γ 誘導的IDO1 和CD274 在小鼠胰腺癌細胞中表達，小鼠總體存活率顯著提高，提示CDK1 可能是胰腺癌治療的靶點之一。

ECT2 是GTP 酶Rho 家族的鳥嘌呤核苷酸交換因子，ECT2 在結直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達［11-13］，可能與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲相關。LI 等［14］研究發現，轉錄共激活因子相關蛋白1（YAP1）在胰腺癌惡化起著關鍵作用，通過YAP1 抑制劑降低ECT2 蛋白表達，可以降低胰腺癌細胞在原發部位和轉移性肝癌的生長，為早期檢測和治療胰腺癌提供了新的思路。有研究發現，ECT2 可通過RhoA-ERK 信號通路調控VEGF 和MMP9 的表達，抑制食管鱗狀細胞癌增殖、侵襲、遷移和腫瘤的發展［11］。MANSOUR 等［12］認為，ECT2 可能是乳腺癌的標志物；HIRATA等［13］對242例非小細胞肺癌和240 例食管鱗狀細胞癌進行臨床觀察，發現ECT2 陽性腫瘤患者的生存期較ECT2 陰性患者縮短。

NUSAP1 是增殖細胞中所需的微管結合蛋白，NUSAP1作為細胞有絲分裂調控因子，其異常表達可能通過影響細胞有絲分裂過程而導致細胞癌變。LIU等［15］報道，NUSAP1表達與腫瘤組織病理學分級、浸潤深度、淋巴結轉移有關，且NUSAP1高表達患者的生存期明顯低于NUSAP1 低表達患者。但NUSAP1 上調的分子機制仍然未知，先前研究報道NUSP1 可能通過調控BTG2/PI3K/AKT 信號通路抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移和轉移［16］。但關于胰腺癌與NUSAP1關系的報道目前少見。

RRM2是一種參與DNA合成和損傷修復的限速酶，在細胞增殖、侵襲、遷移、血管生成等過程中起著至關重要的作用。利用生物信息學分析，RRM2 過表達可能是腫瘤進展的重要組成部分，也是許多癌癥的生物標志物，為RRM2 做為癌癥新的治療靶點提供了依據。YANG 等［17］報道，鐵死亡是由脂質過氧化物引發的細胞死亡過程與肝癌發生發展過程密切相關，RRM2 的磷酸化通過谷胱甘肽合成酶以維持谷胱甘肽水平防止鐵死亡。RüSTEM 等［18］研究發現，GW8510 能夠顯著降低RRM2 蛋白水平，與吉西他濱協同作用可抑制胰腺癌細胞增殖和遷移。

TOP2A 是一種控制DNA 拓撲狀態的酶，它在有絲分裂過程中催化雙鏈DNA 斷裂并促進基因轉錄。研究顯示，TOP2A 在各種癌癥中過度表達。CHEN等［19］通過生物信息方法證實，TOP2A 對胰腺癌具有很高的診斷價值，但并未深入探討與胰腺癌作用機制。DONG 等［20］報道，TOP2A通過調節SnaiL表達觸發上皮間質轉化并促進肝癌進展。PEI 等［21］研究認為，TOP2A是miR-139的直接靶點，TOP2A通過激活β-catenin信號通路促進胰腺癌細胞增殖和遷移。這提示TOP2A 在胰腺癌的發生發展中也具有重要作用。

綜上所述，本研究使用生物信息學的方法挖掘出 6 個基因 ANLN、CDK1、ECT2、NUSAP1、RRM2、TOP2A 可能是胰腺癌發生發展中的重要基因，且與浸潤性乳腺癌、硬囊卵巢、先天性發育不全、喉鱗狀細胞癌、雌激素受體陽性乳腺癌等具有重要關系。這6 個基因可為胰腺癌早期診斷及治療的新靶點，并為胰腺癌的機制研究提供一定的理論基礎。