舒尼替尼耐藥腎癌細胞中circTMBIM6表達變化及其與miR-19a-3p/PPARα軸的調控關系

艾尼瓦爾·艾木都拉，張驥馳，張瑞麗，阿不來提·買買提明

1 新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心，烏魯木齊 830054；2 新疆醫科大學第一附屬醫院泌尿中心

腎癌是人類泌尿系統最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其中以腎細胞癌（RCC）最為常見，約占所有腎癌的85%［1］。研究顯示，約33%的RCC 患者在初診時就發現有轉移病灶，最終發展為轉移性腎細胞癌（mRCC）［2］。舒尼替尼是mRCC 一線治療方案，初始反應率高達47%，但9～12 個月后往往發生耐藥和腫瘤進展，提示對舒尼替尼獲得性耐藥［3］。目前關于mRCC 對舒尼替尼耐藥的機制仍未明確，深入了解RCC的耐藥機制有助于為mRCC患者提供更有效的治療策略。研究表明，環狀RNA（circRNA）可介導微小RNA（miRNA）調控靶基因信使RNA（mRNA）表達。circRNA可作為miRNA的分子海綿，與miRNA相互作用來調控信號通路相關基因的表達，從而影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡及調節腫瘤耐藥。但cirRNA 影響舒尼替尼耐藥的分子機制鮮有報道。跨膜Bax抑制劑的母體6（TMBIM6）是一種鈣離子通道樣蛋白，可降低內質網（ER）膜表面表達的鈣離子穩態，它在許多癌癥類型中上調，參與了多種癌癥的發生，而TMBIM6 在腎RCC 中表達和對舒尼替尼耐藥性的影響尚無相關研究。本研究通過體外試驗觀察circTMBIM6 在舒尼替尼耐藥RCC 細胞中的表達，并通過生物信息學預測和體外實驗證實circTMBIM6 調控的 miRNA 和 mRNA，探討 circTMBIM6在RCC細胞舒尼替尼耐藥性的作用機制，以期為RCC的靶向治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎透明細胞癌A498、Caci-1、780-O細胞株購于中科院上海細胞庫。舒尼替尼購于大連美侖生物技術有限公司。DMEM 培養基、PBS、胎牛血清購于以色列BioInd 公司，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA購于美國Biosharp公司，蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，抗體均購自英國Abcam 公司，ECL 顯影液購自美國 Biosharp 公司，CCK-8 試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司。RNA 提取試劑盒購自超研生物科技有限公司（上海）；Lipofectamine 2000 購于美國 Invitrogen 公司，雙熒光素酶檢測報告系統試劑盒、miR-19a-3p mimics 及陰性對照購于美國Promega 公司。野生型和突變型的circTMBIM6 的3′UTR、PPARα mRNA 的3′UTR 雙熒光報告質粒購自上海基因股份有限公司。凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司。酶標儀購于美國Thermo。

1.2 細胞的培養

1.2.1 正常RCC 細胞的培養 取A498、Caci-1、780-O細胞，加入含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素 100 μg/mL 的 DMEM 培養液，置于 37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養，每48 h 更換培養液。當細胞融合達到90%時，0.25%胰酶消化后傳代，取3代細胞進行后續實驗。

1.2.2 舒尼替尼耐藥細胞RCC 的培養 取A498、Caci-1、780-O 細胞，加入含10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM 培養液，加入終濃度為2.5μmol/L 的舒尼替尼，置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養，開始耐藥篩選。倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，待細胞生長至覆蓋瓶底約90%左右時，按1∶2進行傳代并凍存細胞備用。采用低濃度梯度法，分別以2.5、7.5、12.5、20.0 μmol/L 舒尼替尼培養細胞。在同一藥物濃度作用細胞大約傳代15 代左右穩定后增加藥物濃度，最終建立舒尼替尼耐藥細胞A498/S、Caci-1/S、780-O/S。

1.3 舒尼替尼耐藥和正常RCC細胞circTMBIM6表達檢測 采用qRT-PCR法。使用TRIzol試劑分別提取三種耐藥細胞和正常RCC細胞中的總RNA，使用逆轉錄試劑盒將總RNA 轉錄成cDNA。采用SYBR Green PCR 試劑盒 CFX ConnectTMreal-time PCR 檢測系統上進行qPCR。實時熒光定量PCR 采用兩步法PCR 擴增標準程序。qPCR 引物及內參照U6逆轉錄引物由上海博尚生物技術有限公司設計合成。引物序列：上游 5′-TGTGAAGACAAAGGTGTTTTTGA-3′，下游：5′-TCAATATCAGGGAGCCCAAG-3′。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 A498、Caci-1、780-O 細胞 PPARα 蛋白檢測采用 Western blotting 法。取 A498、Caci-1、780-O 細胞，加入RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg 總蛋白進行電泳，轉膜后5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜3 次，加入PPARα 及 GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3 次。ECL 化學發光顯像。采用Image J 圖像分析軟件，以β-actin 為內參，計算PPARα與內參蛋白灰度值的比值，獲得PPARα蛋白相對表達量。

1.5 circTMBIM6 靶 向 miRNA 和 RNA 的 預 測 及驗證

1.5.1 miR-19a-3p 與 circTMBIM6、PPARα mRNA靶向關系的預測 采用circRNA interactome 數據庫，預測 miR-19a-3p 與 circTMBIM6 的 3′非翻譯區（3′UTR）是否可能存在互補結合。采用Targetscan數據庫，預測 miR-19a-3p 與 PPARα mRNA 的 3′UTR是否存在直接結合。

1.5.2 miR-19a-3p 與 circTMBIM6、PPARα mRNA結合位點的驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。以pmirGLO 為載體，構建包含結合位點的野生型及突變型 circTMBIM6 3′UTR 和 PPARα mRNA 3′UTR質粒，然后轉染至A498、Caci-1、780-O 細胞，同時分別轉染 miR-19a-3p mimics 或 miR-NC 陰性對照，檢測雙熒光素酶報告基因活性。

1.5.3 circTMBIM6 對 miR-19a-3p 表達的調控作用觀察 將A498、Caci-1、780-O 細胞分為抑表達組與空白對照組，以Lipofectamine2000 分別轉染sicircTMBIM6、si-NC+miR-NC。采用qRT-PCR 法檢測細胞miR-19a-3p的相對表達量，檢測步驟同1.3。

1.5.4 miR-19a-3p 對 PPARα mRNA 和蛋白表達的調控作用觀察 將A498、Caci-1、780-O 細胞分為miR-19a-3p 過表達組、miR-19a-3p 抑表達組與空白對照組，以Lipofectamine 2000 分別轉染miR-19a-3p mimics、miR-19a-3p inhibitor、si-NC+miR-NC。24 h后收集各組細胞，采用qRT-PCR 法檢測細胞PPARα mRNA、Western blotting法檢測PPARα蛋白，檢測步驟同1.3。

1.5.5 circTMBIM6 通 過 miR-19a-3p 靶 向 調 控PPARα 表達的作用觀察 將A498、Caci-1、780-O 細胞分為陰性對照組、miR-19a-3p抑制組、circTMBIM6抑制組，分別轉染si-NC+miR-NC、si-NC+miR-19a-3p inhibitor、si-circTMBIM6+miR-NC、si-circTMBIM6+miR-19a-3p inhibitor。 采 用 qRT-PCR 和 Western blotting法檢測PPARα mRNA 和蛋白表達，檢測步驟同1.3。

1.6 舒尼替尼耐藥RCC 細胞中circTMBIM6 與miR-19a-3p/PPARα 軸的調控作用觀察 將A498/S、Caci-1/S、780-O/S 細胞分為陰性對照組、miR-19a-3p 抑制組、circTMBIM6 抑制組，分別轉染si-NC+miR-NC、si-NC+miR-19a-3p inhibitor、si-circTMBIM。加入100 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，上酶標儀測量各孔450 nm 處的OD 值，計算細胞增殖抑制率（%）=［（OD對照孔-OD實驗孔）/OD對照孔］×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.7 統計學方法 采用SPSS18.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用One-way ANOVA 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 舒尼替尼耐藥與正常RCC細胞circTMBIM6表達比較 A498、Caci-1、780-O 細胞circTMBIM6 相對表達量分別為 1.00 ± 0.11、3.42 ± 0.32、3.64 ±0.63，A498/S、Caci-1/S、780-O/S 細胞 circTMBIM6相對表達量分別為3.64±0.71、7.91±0.80、9.47±0.78。與正常 RCC 細胞比較，A498/S、Caci-1/S、780-O/S 細胞 circTMBIM6 表達水平均升高（P均＜0.01）。

2.2 circTMBIM6 與 miR-19a-3p 和 PPARα 靶向關系的預測結果 Starbase 數據庫預測miR-19a-3p 與circTMBIM6 的 3′UTR 存在結合區域，Targetscan 數據庫預測 miR-19a-3p 與 PPARα mRNA 的 3′UTR 存在潛在的結合區域。見表1、2。

表1 miR-19a-3p與circTMBIM6 3′UTR結合位點的預測結果

表2 miR-19a-3p與PPARα 3′UTR結合位點的預測結果

2.3 miR-19a-3p 與 circTMBIM6、PPARα mRNA 靶向結合的驗證結果 miR-19a-3p mimics+circTMBIM6 WT 組熒光素酶活性低于circTMBIM6 WT+miR-NC 組（P＜0.05），miR-19a-3p mimics+circTMBIM6 MUT組與circTMBIM6 MUT+miR-NC組熒光素酶活性無統計學差異（P＞0.05），說明circTMBIM6-WT 能夠與miR-19a-3p 結合，見表3。轉染miR-19a-3p mimics 可以降低野生型 PPARα mRNA 3′UTR 熒光素酶報告基因活性（P＜0.05），但對突變型PPARα mRNA 3′UTR 報告基因活性無顯著影響（P＞0.05），提示PPARα是miR-19a-3p的靶點，見表4。

表3 miR-19a-3p對circTMBIM6 3′UTR熒光素酶報告基因活性調控（）

表3 miR-19a-3p對circTMBIM6 3′UTR熒光素酶報告基因活性調控（）

注：與miR-NC組比較，*P＜0.05。

circTMBIM6-WT 1.02±0.28 0.44±0.48*組別miR-NC組miR-19a-3p mimics組circTMBIM6-MUT 0.97±0.28 0.88±0.14

表4 miR-19a-3p對PPARα mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性調控（）

表4 miR-19a-3p對PPARα mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性調控（）

注：與miR-NC組比較，*P＜0.05。

組別miR-NC組miR-19a-3p mimics PPARα-WT 1.12±0.25 0.41±0.24*PPARα-MUT 1.24±0.45 1.11±0.17

2.4 circTMBIM6 對miR-19a-3p 表達的影響 三種RCC 細胞中，circTMBIM6 抑表達組 miR-19a-3p 表達均高于空白對照組（P均＜0.05）。見表5。

表5 circTMBIM6對miR-19a-3p表達的影響（）

表5 circTMBIM6對miR-19a-3p表達的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別786-O 2.13±0.64*0.49±0.13 miR-19a-3p circTMBIM6抑表達組空白對照組A498 4.12±0.65*0.15±0.57 Caki-1 3.37±0.35*0.34±0.21

2.5 miR-19a-3p 對 RCC PPARα mRNA 及蛋白表達的影響 三種RCC 細胞中，PPARα mRNA 及蛋白水平在抑表達組＞對照組＞過表達組（P均＜0.05），見表6、7。

表6 miR-19a-3p對PPARα mRNA表達的影響（）

表6 miR-19a-3p對PPARα mRNA表達的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別PPARα mRNA miR-19a-3p抑表達組miR-19a-3p過表達組空白對照組786-O 2.13±0.64*1.12±0.25*0.49±0.13 A498 4.12±0.65*1.11±0.89*0.15±0.57*Caki-1 3.37±0.35*0.89±0.22*0.34±0.21

表7 miR-19a-3p對PPARα蛋白表達的影響（）

表7 miR-19a-3p對PPARα蛋白表達的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別PPARα蛋白miR-19a-3p抑表達組miR-19a-3p過表達組空白對照組786-O 3.13±0.44*0.42±0.22*1.23±0.11 A498 6.20±0.21*1.34±0.27*3.24±0.34 Caki-1 4.37±0.35*0.77±0.14*2.34±0.21

2.6 舒尼替尼耐藥RCC 細胞中circTMBIM6 通過miR-19a-3p 靶向調控PPARα 表達 在舒尼替尼耐藥 RCC 細胞系中，miR-19a-3p 抑制組 PPARαmRNA和蛋白表達較陰性對照組上調，circTMBIM6 抑制組PPARα mRNA和蛋白表達較陰性對照組下調（P均＜0.05）。見表8、9。

表8 舒尼替尼耐藥RCC細胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα mRNA表達的影響（）

表8 舒尼替尼耐藥RCC細胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα mRNA表達的影響（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

786-O/S 1.34±0.24 3.45±0.21*0.34±0.23*組別陰性對照組miR-19a-3p抑制組circTMBIM6抑制組PPARα mRNA A498/S 1.11±0.89 4.12±0.65*0.15±0.57*Caki-1/S 1.02±0.13 3.21±0.23*0.43±0.11*

表9 舒尼替尼耐藥RCC細胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα蛋白表達的影響（）

表9 舒尼替尼耐藥RCC細胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα蛋白表達的影響（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

786-O/S 2.67±0.33 6.32±0.43*1.55±0.89*組別陰性對照組miR-19a-3p抑制組circTMBIM6抑制組PPARα蛋白A498/S 2.23±0.53 4.50±0.60*1.23±0.23*Caki-1/S 2.79±0.23 5.11±0.76*0.96±0.64*

2.7 circTMBIM6 通 過 miR-19a-3p/PPARα 軸 對RCC 細胞舒尼替尼耐藥性的影響 circTMBIM6 抑制組細胞增殖抑制率高于miR-19a-3p 抑制組和陰性對照組（P均＜0.05）。見表10。

表10 各組舒尼替尼耐藥RCC細胞增殖抑制率比較（%，）

表10 各組舒尼替尼耐藥RCC細胞增殖抑制率比較（%，）

注：與circTMBIM6抑制組比較，*P＜0.05。

組別細胞增殖抑制率A498/S 20.98±1.08*13.56±4.17*62.45±1.69 786-O/S 25.27±2.02*14.71±3.21*67.79±1.25 Caki-1/S 22.73±2.46*14.07±2.84*65.09±2.75陰性對照組miR-19a-3p抑制組circTMBIM6抑制組

3 討論

近年來，以舒尼替尼為首的酪氨酸激酶抑制劑的研究在mRCC 治療方面取得了很大進展［4］。舒尼替尼可以有效抑制腫瘤血管生成，最終抑制腫瘤生長，但耐藥性是制約療效的瓶頸。目前對于腎癌臨床無有效治療方法，其分子生物學基礎及調控機制尚不完全清楚。因此，我們迫切需要了解腎癌的發病及耐藥機制，從而為mRCC 患者提供更有效的治療策略。

circRNA 作為 miRNA 和 lncRNA 之后新的研究熱點，對腫瘤的影響逐漸被認識。由于其特殊的結構，circRNA 比lncRNA 更穩定，更適合于腫瘤的診斷和治療。circRNA 是由前體RNA 剪接而形成的環狀結構，主要由編碼蛋白質基因的外顯子產生。circRNA 作為一種調控RNA，可以促進基因轉錄、調節選擇性剪接、抑制miRNA 成熟、促進蛋白—蛋白相互作用和miRNA 海綿等多種功能。此外，circRNA-miRNA軸可能是腫瘤治療的潛在靶點并在腫瘤的診斷和預后中具有巨大潛能。TMBIM6 又稱Bax-1 抑制劑，MBIM6 基因位于 12p13.12 號染色體上，是一種位于內質網膜上的陽離子（Ca2+載體），包含6 個跨膜Bax 抑制劑基序。TMBIM6 在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌和肝癌等多種腫瘤類型中表達上調，并改變葡萄糖代謝和激活鈉—氫交換器來促進癌癥轉移［5-6］。研究發現，TMBIM6 缺失或敲除會抑制原發腫瘤的生長。此外，TMBIM6 可上調mTORC2 的激活，并刺激糖酵解、蛋白質合成、脂質合成基因和糖基化蛋白的表達。研究發現，TMBIM6拮抗劑可以阻止TMBIM6 與mTORC2 結合，降低mTORC2 活性，還可以調節TMBIM6 泄漏的鈣離子，進一步抑制腫瘤的形成和進展［7］。DOYCHEVA 等［8］發現，TMBIM6 是內質網應激誘導凋亡的一種新的調節因子。根據KIM等［9］的研究，TMBIM6是一種跨膜Bax 抑制劑，可以參與順鉑誘導生殖毒性的分子機制；對野生型和TMBIM6 缺陷小鼠模型注射順鉑后，突變型小鼠內質網應激水平和蛋白質羰基化水平高于野生型小鼠。經慢病毒轉染的突變小鼠TMBIM6 表達后，睪丸和血清中的各項指標均可恢復，提示TMBIM6 可通過誘導HO-1 來保護順鉑致睪丸毒性。盡管許多證據支持TMBIM6參與了多種癌癥的發生，但TMBIM6 在RCC 耐藥進展中作用的分子機制的文獻較少。我們研究TMBIM6在RCC對靶向藥物舒尼替尼耐藥中的作用，有一定的前沿意義。本研究結果顯示，對RCC細胞系A498、Caki-1、780-0進行耐藥培養后，耐藥RCC細胞中的circTMBIM6表達顯著上升，提示circTMBIM 在RCC 細胞對舒尼替尼的耐藥過程中發揮作用。

cirRNAc 作為miRNA 海綿，可以競爭性地結合miRNA，從而影響miRNA 的活性和下游靶基因的表達，這一機制已在多種腫瘤中得到證實，但是RCC對舒尼替尼耐藥的機制尚未清楚。故本研究首先探討circTMBIM6 調控的下游miRNA 及其靶基因。本研究通過 Starbase 數據庫預測 circTMBIM6 3′UTR 中存在miR-19a-3p 目標堿基序列，通過生物信息學軟件Targetsan 預測 PPARα 可能為 miR-19a-3p 的潛在靶基因，并采用雙熒光素酶報告實驗進行了進一步的證明。后續通過qRT-PCR 驗證，結果顯示，轉染si-circTMBIM6 降低miR-19a-3p 表達水平，進一步揭示circTMBIM6競爭性結合miR-19a-3p并升高其表達。

miR-19a-3p 屬于miRNA-17-92 基因簇。它位于人類染色體13q31.3，具有重要的生物學功能。研究顯示，miR-19a/b 能夠靶向腫瘤抑制因子MXD1，調控胃癌細胞的轉移，通過PITX1 下調影響轉錄激活的PDCD5 促進細胞惡性，并預測胃癌的不良預后。YANG 等［12］發現，miR-19a-3p 在小鼠乳腺癌細胞中可下調M2表型巨噬細胞的表達，而miR-19a-3p在脊椎動物中廣泛保守。miR-19a-3p mimic 基因轉染RAW264.7 巨噬細胞后，Fra-1 基因的表達明顯受到抑制（Fra-1基因作為支持乳腺癌侵襲發展的原癌基因），并降低下游基因Fra-1、VEGF、STAT3 和PS的表達，同時通過熒光素酶報告系統驗證miR-19a-3p與Fra-1的結合活性。由此可見，miR-19a-3p可下調M2 巨噬細胞的M2 表型，在上調Fra-1 表達、誘導M2 巨噬細胞極化中發揮重要作用。FENG 等［13］分別構建miR-19a-3p 模擬質粒和空白對照質粒，轉染DU145細胞，發現過表達miR-19a-3p能夠抑制SOX4蛋白表達，從而抑制DU145 細胞的遷移和侵襲，說明miR-19a-3p 通過SOX4 抑制前列腺癌細胞的遷移、侵襲和EMT。

本研究結果顯示，轉染miR-19a-3p inhibitor 可在蛋白及mRNA 水平負向調控PPARα。舒尼替尼耐藥的RCC細胞中circTMBIM6表達顯著上升，并通過與miR-19a-3p結合，促進PPARα 表達。由于本課組前期研究發現敲低PPARα 通過激活NF-κB 信號通路促進舒尼替尼對RCC 細胞的藥物敏感性［14］，提示PPARα可能參與耐藥調控過程。

為了探討 circTMBIM6/miR-19a-3p/PPARα 軸在RCC 舒尼替尼的耐藥過程中調控機制。進一步探討這兩個非編碼RNA 是否可以調節PPARα 的表達影響RCC 對舒尼替尼敏感性，我們將si-NC+miRNC、si-NC+miR-19a-3p inhibitor、si-circTMBIM6+miR-NC 分別轉染到舒尼替尼耐藥的RCC 細胞，結果顯示，抑制 miR-19a-3p 后，PPARα 基因和蛋白表達顯著上調，細胞增殖抑制率下降，細胞活性增強，RCC 細胞對舒尼替尼的耐藥性增加；而抑制circRNA-TMBIM6 可 上 調 miR-19a-3p 表 達 ，抑 制PPARα 基因和蛋白表達，細胞增殖抑制率升高，細胞存活率降低，從而提高RCC 細胞對舒尼替尼的敏感性。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析和進一步驗證試驗，初步顯示circTMBIM6通過海面吸附作用 miR-19a-3p，影響PPARα 表達，調控 RCC 對舒尼替尼的敏感性。因此，circRNA TMBIM6可能是潛在的RCC耐藥治療新靶點。