覆膜高溫好氧堆肥過程中微生物群落組成及變化規律分析

潘志針，陳 崢，劉 波，劉 欣，肖榮鳳，阮傳清，鄭雪芳，史 懷，王階平

(福建省農業科學院農業生物資源研究所， 福建 福州 350003)

有機固體廢棄物是我國最主要的面源污染物，其來源主要包括畜禽養殖廢棄物、城市污泥、城市垃圾、農作物秸稈等[1]。目前，有機固體廢棄物的處理方式主要有填埋、焚燒、厭氧消化、堆肥等[2]。堆肥是實現有機固體廢棄物無害化和資源化利用的主要手段，通過微生物的分解與轉化等生理代謝功能，將有機物轉化為腐殖質、有效態氮、有效態磷和其他有機物等。同時堆肥過程中產生的高溫可以有效地殺滅有機固體廢棄物中的病原菌和寄生蟲等有害生物，減少面源污染并實現資源的有效利用，實現養分元素的循環與平衡[3-5]。

傳統堆肥工藝存在生產周期長、堆肥效率低等缺點，還會產生惡臭、酸雨等新的環境污染問題[6]。為實現有機固體廢棄物的快速堆肥，并減少臭氣物質的排放，國內外研究者在堆肥條件控制、工藝優化、堆肥出發菌種的添加及原料配比等方面做了大量的研究[7-9]。解開治等[10]通過接種微生物菌劑的方式加快了豬糞堆肥進程。王建才等[11]通過添加外源菌劑的方式延長了堆肥的高溫時間。麻仲花等[12]通過調節不同堆肥原料的配比，提高了雞糞堆體的溫度，加速堆肥腐熟和抗生素的降解。功能膜覆蓋好氧堆肥由于其對氣溶膠，氣候和臭氣的綜合防治效果，被廣泛地應用于堆肥工藝，在美國、西班牙、瑞典等眾多國家被認可為封閉反應器式系統[13]。覆膜好氧發酵技術最早是在20世紀80年代由德國的Baden-Baden提出，經過技術的不斷完善，如今技術最成熟的公司為德國的UTV AG公司，核心產品為GORE Cover膜[14]。GORE膜主要成分為膨脹聚四氟乙烯膜(e-PTEF)，它被夾在兩層具有防紫外線和耐腐蝕的聚酯膜中間。GERO膜具有絕緣和增壓作用，能夠幫助系統保持溫度，使堆體中的溫度分布均勻，有利于滅殺病原體。此外，0.2 um孔徑能有效的阻止灰塵、氣溶膠和微生物向外擴散。堆肥發酵過程中，GERO膜的內表面會形成一層冷凝水膜，大多數的臭氣物質，如氨氣、硫化氫、揮發性有機化合物等，都會溶解于冷凝水膜中，之后又隨著水滴回落到堆體中，重新被微生物分解。因此，覆膜高溫堆肥能有效地減少堆肥過程中臭氣物質的排放及微生物的逸散[13]。但對于覆膜高溫好氧堆肥過程中微生物群落組成及變化規律則鮮有報道。

本研究選用福建省福州市城市污泥和木屑作為堆肥材料，采用德國UTV-GORE膜作為覆膜材料，利用高通量測序的技術手段，揭示覆膜高溫好氧堆肥的不同堆肥階段微生物組成及其變化規律，為覆膜高溫好氧堆肥在有機固體廢棄物無害化處理及資源化利用等方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究采用槽式覆膜高溫好氧發酵工藝(覆膜材料為德國UTV-GORE膜)研究覆膜高溫好氧堆肥下微生物群落的變化。發酵物料為福州城市污水處理廠的脫水污泥和木屑樣本等，將其混勻后送入長40 m、寬8 m、高2.3 m發酵槽內，進行覆膜高溫堆肥處理。每個發酵槽底部均設有曝氣管道，采用高壓鼓風機對堆體進行通風供氧。堆肥周期為28 d的覆膜高溫堆肥。采樣的時間點設置在堆肥的第0(發酵初始)、3(高溫期)、9(中高溫期)、27 d(中溫期)，分別在發酵槽的前段，中段和尾段采用5點取樣法進行隨機取樣。取距表層0～20 cm的樣本標記為表層堆體(surface layer，簡稱S)，樣本編號為S0、S3、S9、S27分別表示第0、3、9、27 d取的表層堆體樣本。取距表層70 cm的樣本標記為下層堆體(bottom layer，簡稱B)，樣本編號為B0、B3、B9、B27，分別表示第0、3、9、27 d取的下層堆體樣本。將樣本混勻后進行微生物群落的分析，每組樣本重復3次，合計24個樣本。

1.2 溫度監測

使用金屬溫度計，在發酵槽的5個固定位置記錄發酵物料的溫度，取其平均值為當日堆體溫度。

1.3 不同堆肥階段樣本DNA提取、Illumina Miseq高通量測序

采用E.Z.N.A.?soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取堆肥樣本微生物群落總DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000測定DNA的濃度及純度。使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因的V3～V4可變區進行PCR擴增[15]，基于Illumina Miseq PE300平臺進行高通量測序分析(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。使用fastp[16](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.19.6)軟件對雙端原始測序序列進行質控，使用FLASH[17](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.11)軟件進行拼接。使用UPARSE軟件[18](http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[19](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2) 對每條序列進行物種分類注釋。通過預測的16S拷貝數對OTU進行歸一化，利用BugBase預測微生物致病性(Pathogeic)等表型進行預測。采用FAPROTAX對微生物的功能進行預測。

1.4 數據處理與分析

采用mothur軟件計算Alpha多樣性的Chao、Shannon指數等，并采用Wilxocon秩和檢驗進行Alpha多樣性的組間差異分析，采用fdr方法對p值進行多重校正，使用bootstrap計算置信區間，使用雙尾檢驗，置信度為0.95。用LEfSe分析(Linear discriminant analysis Effect Size)(LDA>4)確定不同堆肥階段從門到屬水平豐度顯著差異的細菌類群。利用R語言vegan包進行ANOSIM分析，R語言(version3.3.1)mixOmics包中plsda分析，繪制偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)圖。利用R語言繪制物種Venn圖，群落柱形圖和群落heatmap圖等[20]。

2 結果與分析

2.1 覆膜高溫好氧堆肥過程中的溫度變化

由圖1可知，與傳統堆肥工藝相比，覆膜高溫好氧堆肥工藝的升溫期很短，能迅速達到65℃以上并維持7 d，在第3 d達到了最高溫(74.64±2.99)℃。在第9 d的時候溫度降至65℃以下，并保持55℃以上的溫度維持7 d。在第17 d時堆肥溫度降至50℃以下，并保持40℃以上的溫度維持12 d。整個覆膜高溫好氧堆肥的周期為28 d，之后結束覆膜堆肥，對堆體進行翻堆后轉移至另一個無覆膜的發酵槽進行14 d陳化處理。熊建軍等[21]研究普通槽式好氧堆肥，在第3 d的堆體溫度才達到56℃以上，第5 d的時候達到最高溫71℃，第3～10 d的堆體溫度維持在55℃以上，第11 d堆體溫度降至48℃以下。因此，覆膜高溫好氧發酵與普通的好氧發酵相比，能更迅速地進入高溫期，發酵溫度遠高于普通好氧發酵，55℃以上的高溫時間更是達到了16 d，遠高于普通好氧堆肥的8 d。

圖1 覆膜高溫好氧堆肥過程的溫度變化Fig.1 Temperature changes during the film-covered high temperature aerobic composting process

2.2 不同堆肥階段微生物豐度及多樣性指數

通過對Illumina MiSeq的數據進行質控和拼接，從24個樣本獲得1 143 180條高質量序列，每個樣本的有效序列數目的范圍為32 796～67 932條，每個樣本的平均序列長度范圍為410～415 bp。按最小序列數對所有樣本進行抽平處理，在相同的測序深度下進行OTUs聚類分析，這些序列共聚成4 559種OTUs。如表1所示為堆體細菌多樣性和豐度的表征，序列覆蓋度都達到97%以上，覆蓋度好。sobs指數和chao指數表征細菌的豐度，指數越高細菌的豐度越高。同一層發酵樣本隨著發酵時間的增加，細菌的豐度和多樣性都呈現出下降的趨勢。下層發酵樣本中細菌的多樣性和豐富度要高于表層堆體。

表1 不同堆肥階段細菌多樣性與豐度表征

2.3 不同堆肥階段微生物群落的差異

采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表的序列進行分類學分析，通過對Silva數據庫的比對分析，不同堆肥時期的24個樣本共鑒定到49個門、154個綱、356個目、571個科、1 081個屬和2 048個種的微生物信息。由圖2可知，8個組所共有細菌屬為359個，占屬總數的33%，每個組所獨有的微生物屬較少。下列的柱狀圖所示為不同堆肥階段細菌屬水平變化，呈現下降的趨勢，與α多樣性的結果一致。

圖2 不同堆肥階段樣本的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the samples at different composting stages

采用經典的偏最小二乘回歸模型(PLS-DA)，能有效的對組間觀察值進行區分，是一種有監督的分組判別的分析方法。由圖3可知，分類水平選用屬水平，表層堆體和下層堆體的細菌群落差異較小，無顯著性差異。發酵的初始樣本(第0 d)聚成一類，發酵高溫期的樣本聚成一類(第3 d)，發酵中高溫期和中溫期的樣本(第9 d和第27 d)聚成一類。彼此的距離大，說明覆膜高溫好氧堆肥高溫期的細菌菌群與其他堆肥階段的菌群存在著顯著性差異。

2.4 不同堆肥階段細菌群落在門水平組成及變化規律

由圖4可知，覆膜好氧堆肥的優勢菌門由綠彎菌門Chloroflexi、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteriota、厚壁菌門Firmicutes、芽單胞菌門Gemmatimonadota、酸桿菌門Acidobacteriota、擬桿菌門Bacteroidota、髕骨細菌門Patescibacteria、粘球菌門Myxococcota、糞熱桿菌門Coprothermobacterota、浮霉菌門Planctomycetota和硝化菌門Nitrospirota組成(相對豐度>2%)。表層堆肥樣本和下層堆肥樣本的細菌組成差異較小。綠彎菌門在整個發酵堆肥過程中為最主要的優勢門。在發酵初期和最高溫期的相對豐度為20%～33%，在中高溫期和中溫期大量擴增，在第27 d的相對豐度達到了最高(49%～51%)。變形菌門在整個堆肥過程中豐度僅次于綠彎菌門，是第二大優勢門。變形菌門包含著大量病原菌，如大腸桿菌和沙門氏菌等，在發酵的初始樣本中豐度高，相對豐度為19%，經過27 d的高溫堆肥后相對豐度降至6%以下。放線菌門的豐度在高溫期較高，相對豐度達到了17%～24%，厚壁菌門在高溫期的豐度較低，相對豐度只有4%。芽單胞桿菌門在發酵的初始樣本中豐度較低(相對豐度為0.8%～1%)，隨著堆肥時間的延長，逐漸增加，在27 d時達到了最高(相對豐度為7%～9%)。酸桿菌門和擬桿菌門在堆肥初始的樣本中豐度較高，隨著發酵時間的延長，相對豐度逐漸降低，在第27 d時達到了最低。

圖3 不同堆肥階段微生物群落PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA diagram of the microbial communities at different composting stages

圖4 不同堆肥階段細菌在門水平的組成及相對豐度Fig.4 Composition and relative abundance of the bacteria at phylum level in different composting stages

為了更好地比較堆肥初始樣本經過27 d的覆膜高溫好氧堆肥后的微生物群落的變化，比較了第0 d和第27 d 堆肥樣本的細菌群落在門水平的變化。由于表層堆體的微生物組成與下層堆體的較為類似，合并表層和下層堆體。經過27 d堆肥后細菌門水平的變化見圖5。經過27 d的堆肥，綠彎菌門、芽單胞菌門、粘球菌門相對豐度極顯著提高(P<0.01)，變形菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門和硝化菌門相對豐度極顯著的降低(P<0.01)，酸桿菌門和浮霉菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

注：P值用*、**標識，*表示0.01

2.5 不同堆肥階段細菌群落在屬水平的組成及變化規律

由圖6可知，表層堆體和下層堆體的微生物群落結構較為類似，鏈霉菌屬Streptomyces、水恒桿菌屬Mizugakiibacter和馬杜拉放線菌屬Actinomadura在高溫期豐度最高，在發酵的初始樣本及中高溫和中溫期的豐度則較低。鏈霉菌屬等能較好地適應高溫，在高溫期豐度最高，參與了纖維素分解等重要過程，這與馮紅梅等[22]報道的相一致。Kouleothrix在堆肥初始樣本中豐度較高，經過高溫堆肥后豐度逐漸降低。康奈斯氏桿菌屬conexibacter，IMCC26207和芽胞桿菌屬Bacillus隨著堆肥時間的增加，豐度逐漸下降，在27 d時豐度有顯著的降低。特呂珀菌屬Truepera、厭氧繩菌屬Anaerolinea、小單孢菌屬Micromonospora、熱黃微菌屬Thermoflavimicrobium、球形桿菌屬Sphaerobacter、糞熱桿菌屬Coprothermobacter和Lutispora等在堆肥的初期豐度較低，隨著堆肥時間的增加，豐度逐漸增加，在第27 d時豐度有極顯著的提高。

圖6 不同堆肥階段細菌屬水平群落熱圖Fig.6 Heat map of the bacteria at genus level at different composting stages

圖7 不同堆肥階段LEfSe圖Fig.7 LEfSe diagram at different composting stages

2.6 不同堆肥階段細菌群落LEfSe分析

采用LEfSe分析確定組間具有顯著性差異的物種，先利用非參數Kruskal-Walllis(KW)sum-rank test檢測不同組間的物種豐度差異，獲得顯著性差異物種。然后利用Wilcoxon rank-sum test檢驗上一步的差異物種在不同組間子分組中的差異一致性，最后運用LDA線性判斷分析這些差異物種對組間區別的影響大小。本研究從門到屬水平對覆膜高溫好氧堆肥過程中微生物的變化進行LEfSe分析(圖7)，篩選不同發酵時期差異指示物種，LDA的閾值設置為4。初始表層堆體樣本(S0)中的差異指示物種為伯克氏菌目Burkholderiales，芽球菌綱Blastocatellia，髕骨細菌門，Blastocatellales目，鏈狀芽生菌科Blastocatellaceae。差異指示物種在S3中富集的最多的微生物分別為變形菌門，γ變形菌綱Gammaproteobacteria，黃單胞菌目Xanthomonadales，Rhodanobacteraceae，擬桿菌門，α-變形菌綱Alphaproteobacteria，鏈孢囊菌目Streptosporangiales，擬桿菌綱Bacteroidia，芽單胞菌(從綱到屬)。S9中的差異指示物種為芽單胞菌門和S0134_terrestrial_group。S27中的差異指示物種為SBR1031。B0中的差異指示物種為根瘤菌目Rhizobiales，酸微菌綱Acidimicrobiia，微絲藻菌目Microtrichales，Kouleothrix，暖繩菌(從目到科)。B27中的差異指示物種綠彎菌門，球形桿菌屬Sphaerobacter和Roseiflexaceae。

2.7 堆肥前后微生物群落BugBase和FAPROTAX功能預測

通過BugBase將預測的16S拷貝數對OUT進行歸一化處理，進而預測致病性(pathogenic)等微生物表型分析(圖8)。如圖8a所示，對致病性表型貢獻比較大的細菌門主要有：變形菌門、酸桿菌門、硝化菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。它們都隨著堆肥時間的增加均有顯著的降低。圖8b所示為致病性表型在不同堆肥階段的相對豐度。在發酵初始的樣本中，潛在的致病性較大(致病性參數大于11%)，經過27 d的覆膜高溫堆肥之后，致病性具有極顯著的下降，致病性參數低于5%。綜上，經過27 d的覆膜高溫好氧堆肥能顯著降低堆肥樣本中的潛在致病性，能較好地實現無害化處理。

此外，通過FAPROTAX對不同堆肥階段微生物特性進行了預測(圖9)，結果顯示動物寄生蟲，人類致病菌，細胞內寄生蟲等微生物特性經過27 d的覆膜高溫堆肥，均具有顯著的降低(P<0.05)。植物病原菌經過27 d的覆膜高溫堆肥則體現出極顯著的降低(P<0.01)。

注：a為物種-表型貢獻圖；b為致病性組間差異檢驗圖8 堆肥前后微生物群落Bugbase致病性表型預測Fig.8 Phenotypic prediction of Bugbase pathogenicity of the microbial communities before and after composting

注：P值用*、**標識，*表示0.01

為了進一步研究覆膜高溫好氧堆肥前后堆肥樣本的潛在致病菌的留存情況，分別比較了第0和第27 d堆肥樣本中微生物群落的差異，通過與virulence factor database(VFDB)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)以及已報道的140種潛在致病菌的比對[23-24]。堆肥的初始堆肥樣本中有40種潛在病原菌被比對到。其中分枝桿菌屬(Mycobacterium)、真細菌屬(Eubacterium)、戈登氏菌屬(Gordonia)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭菌屬(Clostridium)和Eggerthella等7個細菌屬經過27 d的覆膜高溫堆肥后具有顯著下降(P<0.05)(圖10)。

圖10 堆肥前后樣本中潛在病原菌豐度Fig.10 Abundance of the potential pathogenic bacteria in the samples before and after composting

綜上所述，通過對堆肥前后微生物群落進行BugBase和FAPROTAX功能預測及潛在病原菌庫進行比對分析，發現覆膜高溫堆肥能很好地降低有害病原菌的豐度，達到無害化的目的。

3 討論與結論

堆肥溫度是影響堆肥效率及資源化利用最關鍵的因子，也是堆肥過程的核心參數。覆膜高溫好氧堆肥的功能膜材料能較好地保持堆體溫度，這極大地縮短了升溫期，延長了高溫的保持時間，縮短了堆肥的周期。覆膜高溫堆肥在第3 d的時候就達到堆肥最高溫(74.64±2.99)℃，保持55℃以上的時間長達16 d，遠高于普通堆肥的保持時間[21,25]。此外，覆膜高溫堆肥能通過控制通氣及水蒸氣外排的方式，調節堆體溫度，堆肥溫度總體處于最佳溫度40～65℃[26]。

堆肥的實質是微生物分解和轉化有機物的代謝過程，細菌作為此代謝過程的主要參與者，其群落的組成及豐度的演變是影響堆肥進程的關鍵因素。本研究采用高通量測序技術，研究覆膜高溫好氧堆肥不同階段的細菌多樣性，共鑒定到49個門、154個綱、356個目、571個科、1 081個屬和2 048個種的細菌。表層堆體和下層堆體的群落結構較為類型，無顯著性差異。堆肥高溫期(第3 d)的群落結構明顯區別于堆肥初始樣本(第0 d)和中高溫期及中溫期(第9 d和第27 d)的群落結構。堆肥的初始樣本中，綠彎菌門、變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門和擬桿菌門是主要的優勢菌，這與鞠峰等[27]等報道的城市污泥的主要優勢菌門相一致。這說明堆肥樣本中城市污泥的群落組成，決定了堆肥初始狀態的群落組成。綠彎菌門在整個堆肥過程中均為第一大菌門，在高溫期后豐度有顯著增加，在第27 d的時候，相對豐度達到了50%。綠彎菌門是一類深度分支的細菌類群，廣泛分布在生物圈各種生境中，如土壤、海洋、海底熱液區，陸地熱泉、地下水、活性污泥、堆肥等生境中，在深水湖泊，堿性熱泉，高山凍土等許多生境中均為優勢菌群。此外參與了地球碳、氮、硫等元素循環，如CO2的固定，纖維素等大分子的降解，NO2-的氧化，吸收利用H2S氣體等[28]。綠彎菌門對高溫具有較好的耐受性，可能參與了纖維素的分解及臭氣物質的吸收等代謝過程。鏈霉菌屬、水恒桿菌屬和馬杜拉放線菌屬在高溫期大量擴增，相對豐度最高，隨后則逐漸降低。高溫期在表層堆體的指示物種為變形菌門，擬桿菌門，芽單胞菌和黃單胞菌目等。

通過BugBase預測微生物的致病性，發現對致病性表型貢獻比較大的細菌門主要有：變形菌門，酸桿菌門，硝化菌門，厚壁菌門和擬桿菌門。這些菌門在堆肥的初始樣本中顯著富集，如變形菌門、厚壁菌門在S0樣本中的相對豐度分別為20%和14%。在經過27 d的覆膜高溫堆肥之后，這些菌門都有顯著的下降。其中變形菌門，擬桿菌門，髕骨細菌門和硝化菌門經過27 d的堆肥，相對豐度極顯著降低(P<0.01)，酸桿菌門和浮霉菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)。致病性參數從S0的13.21%降至S27的5%，從B0的11.64%降至B27的5.13%。通過FAPROTAX對不同堆肥階段群落特征進行預測，發現經過27 d的覆膜高溫堆肥后，堆肥初始樣本中的動物寄生蟲、人類致病菌、細胞內寄生蟲(intracellular parasite)等顯著的下降(P<0.05)，植物的病原菌則有極顯著的下降(P<0.01)。通過與virulence factor database (VFDB)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)以及已報道的140種潛在致病菌的比對，發現堆肥初始樣本中有40種潛在病原菌被比對到。其中分枝桿菌屬，金黃桿菌屬和梭菌屬等7個細菌屬經過27 d的覆膜高溫堆肥后具有顯著下降(P<0.05)。綜上所述，堆肥的初始樣本城市污泥中含有較多的病原微生物，具有較高的致病性，經過27 d覆膜高溫堆肥能有效地降低城市污泥中的有害微生物的含量。

本研究采用Illumina Miseq高通量測序的技術，解析了覆膜高溫好氧堆肥不同階段的微生物組成及變化的規律，嘗試闡明不同堆肥階段的標志微生物，為進一步優化覆膜高溫好氧堆肥工藝奠定理論基礎。此外，通過BugBase和FAPROTAX功能預測及潛在病原菌庫進行比對分析，發現覆膜高溫好氧堆肥能有效地降低堆肥樣本中有害微生物的豐度，這為闡釋覆膜高溫好氧堆肥無害化的機制提供理論支持。