PI3K/AKT信號通路介導脂聯素對腦缺血再灌注大鼠的保護作用

何俊芳，劉新平，呂學海，王斌

腦缺血再灌注損傷的機制可能涉及炎癥、凋亡、氧化應激和細胞自噬等[1]。脂聯素是脂肪細胞產生的一種可與細胞外基質相互作用的細胞因子，具有抗動脈粥樣硬化、抗炎和抗氧化應激等作用[2]。有研究發現，高血壓和腦梗死患者體內血漿脂聯素水平顯著低于正常人群，認為脂聯素對腦缺血再灌注具有保護作用[3]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號通路是細胞內關鍵的信號傳導途徑之一。動物實驗發現，脂聯素預處理可激活PI3K/PKB信號通路，改善大鼠心肌缺血，使用PI3K抑制劑LY294002干預處理可抑制脂聯素對大鼠心肌缺血的改善作用[4]。

本研究通過建立大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血再灌注模型大鼠并給予脂聯素治療或PI3K抑制劑處理，旨在探究脂聯素對大鼠腦梗死的作用機制，以期為腦梗死防治提供基礎實驗依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物建模與分組 雄性健康SD大鼠，體質量250～280 g，適應性喂養7 d。造模手術前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，采用右側頸內動脈（internal carotid artery，ICA）線栓法結扎方法制備MCAO缺血再灌注模型。頸前正中切口后逐層分離，暴露出右頸總動脈、頸外動脈和右側ICA，然后將18 mm單股3～0號尼龍線插入右側ICA并結扎，缺血1.5 h后移除尼龍線實現再灌注。將血流儀的探針固定于大鼠顱骨平面，當檢測顯示大鼠的腦血流量恢復至基線水平表示缺血再灌注成功，則可以縫合切口。待大鼠自然蘇醒后，根據Longa 5分法評估MACO缺血再灌注造模大鼠成功與否[5]。0分：正常；1分：無法伸展對側前爪；2分：向外側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：無法自發行走，意識喪失。1～3分表示建模成功，剔除0和4分的大鼠。

本研究將大鼠分為①假手術組：大鼠接受皮膚切口處理，但是不進行尼龍線插入ICA和結扎，其余操作相同，然后給予大鼠尾靜脈注射0.9%生理鹽水（0.09 mL/100 g）；②模型組：大鼠缺血再灌注2 h后，給予尾靜脈注射0.9%生理鹽水（0.09 mL/100 g）；③脂聯素治療組：采用0.9%生理鹽水溶液將脂聯素（美國Phoenix公司，批號426002）稀釋至2 mg/mL，大鼠缺血再灌注2 h后，按照大鼠體質量一次性給予尾靜脈注射脂聯素（180 μg/100 g）；④PI3K/PKB抑制劑（LY294002，美國Sigma公司，HY-10108）組：大鼠缺血再灌注2 h后，按照大鼠體質量一次性給予尾靜脈注射脂聯素（180 μg/100 g）+LY294004（0.03 mg/100 g）。以上每組15只大鼠。

大鼠腦缺血再灌注24 h后根據Longa 5分法再次進行腦神經功能評分。檢測完神經功能評分后麻醉大鼠，快速斷頭取腦，-20 ℃冷凍處理30 min，剝離腦殼后分離腦組織。每組取5只用于腦梗死面積測定，5只用于腦含水量測定，剩余5只大鼠的腦組織與生理鹽水混合破碎制成組織混液，用于PI3K、PKB、磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated PKB，p-PKB）和脂聯素蛋白表達水平的測定和炎癥因子血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平的測定。

1.2 腦梗死面積和腦含水量測定 將大鼠的腦組織從額極向后做連續冠狀切片（5片），再將腦片置入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）中溫浴30 min。染色結果白色為梗死灶，紅色為正常腦組織。染色后，將腦切片在4%多聚甲醛中固定，采用Image J軟件計算梗死面積，計算公式為：（缺血區面積/腦片面積）×100%。腦組織含水量檢測：每組取5只大鼠的腦組織，去掉嗅球、小腦和低位腦干，稱量為大腦濕質量，烘烤72 h后稱量為干質量。腦含水量（%）=[（濕質量-干質量）／濕質量]×100%。

1.3 PI3K、PKB、p-PKB和脂聯素蛋白表達水平測定 各組分別各取5只大鼠腦組織混液各2 mL，加入1 μL裂解液，將組織混液離心處理（4 ℃，12 000 r/min，20 min），取上清液通過聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白質測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）定量樣品濃度。采用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后再電泳轉移至聚乙烯基氟化物膜，經過5%的牛血清蛋白室溫封閉1 h，然后與兔單克隆抗體PI3K（1∶1000）、兔多克隆抗體PKB（1∶1000）、兔多克隆抗體p-PKB（1∶1000）、兔單克隆抗體脂聯素（1∶1000）和兔單克隆抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1000）一抗在4 ℃下孵育過夜處理。將膜用洗滌緩沖液洗滌5次/分，然后與辣根過氧化物酶標記的兔抗IgG二抗（1∶2000）在室溫下孵育1 h，然后成像并使用Image J軟件對蛋白質條帶進行分析，以灰度值表示。GAPDH用作內部對照，PKB作為p-PKB的比值對照。

1.4 腦組織炎癥因子MDA和SOD水平測定各組分別取5只大鼠的腦組織混液2 m L，3000 r/min離心10 min取上清液，采用SOD檢測試劑盒（南京建成生物技術研究所）和MDA檢測試劑盒（南京建成生物技術研究所）分別檢測SOD和MDA水平。取10 μL上清樣品和40 μL稀釋液于微孔酶標板中，每孔分別加入100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，封孔后37 ℃水浴溫育60 min，去液后洗滌5次。然后每孔加入50 μL底物貯備液稀釋液（1∶200稀釋），37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加入50 μL終止液，MDA測定450 nm波長的OD值，SOD測定550 nm波長OD值。

1.5 統計方法 采用SPSS 18.0軟件進行數據統計分析，正態分布的計量資料用表示，多組間分析比較采用單因素方差檢驗，兩組內再采用最小顯著差異檢驗（LSD-t）。非正態分布數據采用M（P25～P75）進行統計描述，采用非參數檢驗進行組間比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積、腦含水量和神經功能的影響 各組大鼠腦梗死面積、腦含水量和神經功能缺損評分的整體差異均有統計學意義（均P＜0.001）。與假手術組相比，模型組、脂聯素治療組、抑制劑組的腦梗死面積、腦含水量和神經功能缺損評分均升高（均P＜0.001）；與模型組比較，脂聯素治療組大鼠的腦梗死面積、腦含水量和神經功能缺損評分均降低（均P＜0.001），抑制劑組大鼠的腦梗死面積（P=0.292）、腦含水量（P=0.145）和神經功能缺損評分（P=0.406）差異無統計學意義；與脂聯素治療組比較，抑制劑組大鼠的腦梗死面積、腦含水量和神經功能缺損評分均升高（均P＜0.001）（表1）。

表1 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積、腦含水量、神經功能缺損的影響

2.2 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦組織脂聯素蛋白表達水平的影響 假手術組、模型組、脂聯素治療組和抑制劑組大鼠腦組織脂聯素蛋白表達水平分別為0.95±0.03、0.73±0.07、0.92±0.04和0.81±0.03，組間整體差異有統計學意義（F=23.69，P＜0.001）。與假手術組相比，模型組和抑制劑組的腦組織脂聯素蛋白水平降低（均P＜0.001），脂聯素治療組的腦組織脂聯素蛋白水平差異無統計學意義（P=0.318）；與模型組比較，脂聯素治療組的腦組織脂聯素蛋白水平升高（P＜0.001）；與脂聯素治療組比較，抑制劑組的腦組織脂聯素蛋白水平降低（P=0.002）（圖1）。

圖1 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦組織脂聯素蛋白表達水平的影響

2.3 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦組織PI3K/PKB信號通路的影響 各組大鼠腦組織中PI3K（F=25.58，P＜0.001）和p-PKB蛋白（F=17.68，P＜0.001）相對表達水平整體差異有統計學意義。與假手術組相比，模型組大鼠的腦組織PI3K（0.73±0.05vs. 0.93±0.03，P＜0.001）和p-PKB（0.82±0.05vs. 0.97±0.04，P＜0.001）蛋白表達水平均降低，抑制劑組大鼠的腦組織PI3K（0.75±0.04vs. 0.93±0.03，P＜0.001）和p-PKB（0.81±0.04vs. 0.97±0.04，P＜0.0 01）蛋白表達水平也均降低；與模型組比較，脂聯素治療組大鼠的腦組織PI3K（0.89±0.05vs. 0.73±0.05，P＜0.001）和p-PKB（0.94±0.03vs. 0.82±0.05，P＜0.0 01）蛋白表達水平均升高；與脂聯素治療組比較，抑制劑大鼠的腦組織PI3K（0.75±0.04vs. 0.89±0.05，P＜0.001）和p-PKB（0.81±0.04vs. 0.94±0.03，P＜0.001）蛋白表達水平均降低（圖2）。

圖2 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦組織PI3K/PKB信號通路的影響

2.4 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠氧化應激的影響 各組大鼠腦組織中SOD和MDA水平整體差異均有統計學意義（均P＜0.001）。與假手術組比較，模型組、脂聯素治療組和抑制劑組的腦組織中SOD水平降低（均P＜0.001），MDA水平升高（均P＜0.001）；與模型組比較，脂聯素治療組大鼠的腦組織中SOD水平升高（P＜0.001），MDA水平降低（P＜0.001），抑制劑組大鼠的腦組織中SOD（P=0.065）和MDA（P=0.161）水平差異無統計學意義；與脂聯素治療組比較，抑制劑組大鼠的腦組織中SOD水平降低（P＜0.001），MDA水平升高（P＜0.001）。具體數據見表2。

表2 脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦氧化應激的影響

3 討論

腦缺血過程中氧化應激反應加劇，可能導致自由基氧化產物（如MDA）水平的升高，以及抗氧化產物（SOD等）水平的降低[6]。過量自由基的產生會導致機體微環境內自由基和抗氧化物的動態平衡被破壞，進而會加劇炎癥反應和呼吸鏈等一系列生理反應的破壞。

本研究中MCAO大鼠的腦組織壞死，腦水腫明顯，同時出現明顯的神經功能缺損。在反映氧化應激的指標上，MCAO大鼠腦組織內自由基氧化產物MDA水平升高，而對應的抗氧化產物SOD水平降低。當MCAO大鼠接受脂聯素治療后，其腦組織損傷和氧化應激反應的各項指標均得到顯著改善，接近于假手術組大鼠的生理水平，說明脂聯素對腦缺血再灌注損傷可能存在一定的治療和改善作用。有研究也顯示脂聯素對急性腦缺血再灌注大鼠具有一定的神經保護作用，與本研究結果類似[7]。

脂聯素是一種對機體有保護作用的脂肪因子。近期有研究發現，脂聯素與肥胖、高血壓、糖尿病和心腦血管等疾病密切相關，可減輕動脈粥樣硬化病變，在抗炎、抗糖尿病和抗動脈粥樣方面均顯示出了良好的潛力[8]。有研究顯示，腦梗死后脂聯素水平降低，且與不穩定動脈粥樣硬化斑塊形成有關[9]。還有研究顯示，脂聯素基因敲除的MCAO大鼠表現出腦梗死面積和心肌細胞凋亡增加，而當大鼠體內過表達脂聯素時，其腦缺血再灌注損傷相應降低[10]。白浩等[11]的研究顯示，經脂聯素處理后，腦缺血再灌注小鼠的腦梗死面積減少、神經功能改善，同時其腦水腫程度和細胞凋亡情況也均得到改善。本研究中，經脂聯素治療處理的腦缺血再灌注大鼠的腦梗死面積、腦水腫、神經功能缺損均顯著降低，而脂聯素水平升高。這進一步證實了脂聯素在腦缺血再灌注中的抗損傷作用。

PI3K/PKB通路是維持細胞生存的重要信號通路系統。PI3K/PKB可通過減輕細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應進而改善腦缺血再灌注損傷。有研究發現，PI3K/PKB信號通路對缺血動物模型有保護作用[8]。還有研究顯示脂聯素可通過激活PI3K/PKB信號通路改善心肌缺血大鼠的心肌損傷[9-10]。p-PKB是PKB磷酸化的形式，在PI3K/PKB途徑中，p-PKB是一種活化蛋白形式，也是發揮蛋白作用的形式，p-PKB/PKB通路激活的程度主要體現于PKB蛋白中被活化后p-PKB蛋白的含量。本研究中，經過脂聯素治療的腦缺血再灌注大鼠，其腦組織中PI3K和p-PKB蛋白表達水平均升高，提示PI3K/PKB信號通路被激活。對應的，脂聯素治療組大鼠腦損傷減輕，神經功能改善，同時抗氧化產物SOD水平升高，反映體內氧化應激反應改善，提示脂聯素與PI3K/PKB信號通路在改善大鼠缺血再灌注損傷過程中存在相互關系。本研究抑制劑組采用PI3K/PKB信號通路抑制劑LY294002處理，可以逆轉脂聯素對腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷和神經功能改善的作用。這也間接證明PI3K/PKB信號通路在改善腦缺血再灌注大鼠腦損傷中的積極作用。

綜上所述，本研究通過構建MCAO腦缺血再灌注大鼠模型，采用脂聯素治療處理，顯著改善了大鼠的腦損傷情況，說明脂聯素對腦缺血再灌注有明顯保護作用，且該保護機制可能與激活PI3K/PKB信號通路從而抑制氧化應激有關。但本研究存在一定的不足，如脂聯素治療大鼠后，對其細胞生理層面的變化沒有進行探索，這是后續研究需要關注的重點。

【點睛】本研究對MCAO腦缺血再灌注模型大鼠進行脂聯素治療和PI3K/PKB通路抑制劑LY294002干預，發現脂聯素可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其可能通過激活PI3K/PKB通路發揮神經保護作用。