脂肪干細胞源性外泌體對瘢痕成纖維細胞生物學活性的影響

林正杰 江詩海 梁堂釗 任建華 何容涵 胡瑛 王昆 朱蕾

增生性瘢痕是以成纖維細胞過度增殖和細胞外基質堆積為主要特征的一類病理性愈合方式，在臨床上表現為創面邊緣高出皮膚表面、早期充血明顯、可伴有疼痛或瘙癢，可能會引起關節等活動障礙，對患者的生活和心理造成一系列不良影響。目前，臨床上主要采用激光、皮下注射糖皮質激素等非手術治療方法，但這些治療手段都無法有效地治療增生性瘢痕。同時，增生性瘢痕采用單純手術切除復發率較高，不推薦單獨應用。因此，探索一種新的增生性瘢痕的治療方案成為當前迫切需求。

脂肪干細胞（ADSC）被用于治療纖維化，其來源較為豐富，獲取途徑多樣，被廣泛用于研究。ADSC 源 性 外 泌 體（ADSC-Exos）由ADSC分泌，目前研究表明，ADSC-Exos 在創面愈合、瘢痕預防等方面發揮著重要作用。同 時，ADSCExos 能夠有效逆轉心臟、肝臟、腎臟等的纖維化，為纖維化的治療提供新的方向。近年來，有關ADSC-Exos 在增生性瘢痕中作用的研究與日俱增，本課題組通過制備ADSC-Exos 處理瘢痕成纖維細胞，探索ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細胞生物學活性的影響，為后期ADSC-Exos 體內實驗研究奠定堅實的基礎，以期為將ADSC-Exos 用于治療增生性瘢痕提供堅實的理論基礎。

材料與方法

一、細胞來源及主要試劑

ADSC、瘢痕成纖維細胞、細胞培養板、培養瓶購自康寧公司，DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液購自美國Gibco 公司。CCK-8 試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。Ⅰ型膠原（COL1）、COL3 抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體購自美國Abcam 公司。TRIzol RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量（qRT）-PCR 試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

二、細胞培養

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基（含100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素）培養人瘢痕成纖維細胞；置于37 ℃含5% CO的環境中培養，2～3 d 傳代1 次，當細胞生長至體積達80%～90%時，利用含0.25%胰酶進行常規傳代。本研究采用第3 代ADSC 所提取的ADSC-Exos 進行實驗。

三、ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細胞活性與增殖影響的評估

1. ADSC-Exos 的制備

將5×10的ADSC（第3 代）接種于培養瓶中，待24 h 細胞貼壁后，采用含無外泌體血清的低糖DMEM 培養基饑餓培養48 h，并收集其培養上清，300×g、4℃離心10 min，2000×g、4℃離心20 min，10 000×g、4 ℃離心30 min 后，將上清通過針筒式濾膜過濾器（0.22 μm）過濾，再行100 000×g、4 ℃離心70 min 2 次后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，并通過透射電鏡、粒徑、蛋白免疫印跡法檢測ADSC-Exos。

2. CCK-8 實驗

將3×10個/孔的瘢痕成纖維細胞接種于96孔板中，設置對照組、ADSC-Exos 組，每組設置5 個重復實驗孔，加入等量的PBS、ADSC-Exos 培養，分別于0、12、24、48 h 后通過CCK-8 試劑盒對瘢痕成纖維細胞的增殖進行測定，對各組增殖率進行統計學分析。

3.蛋白免疫印跡法

將瘢痕成纖維細胞接種于6 孔板，然后用ADSC-Exos 處理48 h。對照組細胞培養時間與ADSC-Exos 組相同但不作任何處理。48 h 后用PBS 清洗細胞3 次，然后加入裂解液收集蛋白質，10 000×g 離 心15 min。采 用SDS-PAGE 凝 膠 電泳，用12.5%的分離膠分離蛋白質，在SDS-PAGE凝膠上電泳，然后將其轉移到PVDF 膜上。將膜用5% 脫脂牛奶密封1 h，然后與COL1、COL3、α-SMA 等抗體于4 ℃孵育過夜，樣品用TBST 緩沖液洗滌3 次，用二抗孵育1 h，再用TBST 緩沖液洗去二抗，使用化學發光成像儀成像。每個條帶的灰度值經Image J 軟件分析。

4. qRT-PCR

分析ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細胞纖維化相關指標的影響，將對照組與ADSC-Exos 組處理的瘢痕成纖維細胞依據試劑盒說明書提取細胞總RNA，利用qRT-PCR 檢測纖維化相關指標COL1、COL3、α-SMA 的 表 達，并 通 過2法進行分析，評價經ADSC-Exos 處理后纖維化指標的變化。實驗至少重復3 次。實驗中所涉及的基因對應的引物序列如下，內參GAPDH， forward：5′-GGAGCGCTACCCCTCCAAAAT-3′and reverse：5′-GGCTGCGTTCATACTTCTCATGG-3′；COL1，forward：5′-GTGCGATGACACGATCTGTGA-3′and reverse：5′-CGGTGGTAACTTGGTCGGT-3′；COL3，forward：5′-GCCAAATATGTCGTAGTGACTCA-3′and reverse：5′-GGGCGAGTACCTCCAGTTG-3′；ɑ-SMA， forward：5′-GGCATTCGCAAGACCACCT AC-3′ and reverse： 5′-CGACATGACGTTCATGG CATAC-3′。

四、統計學處理

采用 SPSS 25.0 進行統計分析，使用 GraphPad Prism 8.0.2 進行作圖。3 組數據比較采用重復測量資料的方差分析。P < 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、ADSC、瘢痕成纖維細胞和ADSC-Exos的鑒定

CD90、CD13、CD105、CD44 表 達 陽 性，CD34、CD45 表達陰性，表明該細胞為ADSC（圖1A）。瘢痕成纖維細胞Vimentin 表達陽性，對照為陰性（圖1B）。透射電鏡結果表明，ADSCExos 為典型的杯狀囊泡（圖1C）。粒徑分析表明，ADSC-Exos 的平均直徑為30～150 nm，濃度約為1.36×10個/mL（圖1D）。蛋白免疫印跡顯示，ADSC-Exos 中CD81、CD63 表 達 陽 性，Calneix 表達陰性（圖1E）。這些數據表明本研究成功分離了ADSC-Exos。

圖1 ADSC、瘢痕成纖維細胞和ADSC-Exos 的鑒定

二、ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細胞增殖和纖維化的影響

將ADSC-Exos 與瘢痕成纖維細胞共培養，結果顯示ADSC-Exos 組的瘢痕成纖維細胞增長緩慢（圖2A）。增殖實驗顯示，經ADSC-Exos 處理的瘢痕成纖維細胞增殖率逐漸降低（n = 5，P = 0.017），表明ADSC-Exos 可以抑制瘢痕成纖維細胞的增殖（圖2B）。此外，ADSC-Exos 還能下調COL1、COL3 和α-SMA 的 表 達（圖2C、D）。人COL1、COL3 和α-SMA 的mRNA 表 達 經ADSC-Exos 作用后下調（n = 5，t = 0.670，P = 0.029），表明ADSC-Exos 可以逆轉瘢痕成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，從而減輕瘢痕的纖維化（圖2E）。以上結果證實，ADSC-Exos 可以抑制瘢痕成纖維細胞的生物學功能。

圖2 ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細胞增殖和纖維化的影響

討 論

ADSC 是典型的低分化多能干細胞之一，具有較低的免疫原性，來源豐富。ADSC-Exos 由ADSC分泌，其在創面愈合、預防瘢痕等方面具有重要作用。外泌體從細胞中釋放，參與多個生物學和病理學過程。由于具有攜帶mRNA、蛋白質、微RNA、長鏈非編碼RNA 的能力，外泌體作為細胞信號轉導因子的作用已在許多研究領域中得到確認，其所攜帶的RNA 和蛋白質已被證實在創面愈合中起重要的作用。外泌體在增殖、遷移過程中的作用也有相關的研究。ADSC-Exos 在皮膚創傷愈合中的應用已取得顯著進展。ADSC-Exos 治療增生性瘢痕的應用前景廣闊。

ADSC-Exos 抗纖維化的作用還在肝臟、腎臟及心肌纖維化等方面得到驗證。所以本研究提取ADSC 的培養上清，制備ADSC-Exos，初步探討ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細胞的影響。結果顯示，在ADSC-Exos 的作用下，瘢痕成纖維細胞的增殖和纖維化指標受到影響，這為ADSC-Exos 在增生性瘢痕的治療提供了可靠的實驗證據。同時，在增生性瘢痕的進展過程中自噬扮演著重要的角色。本研究顯示，在增生性瘢痕中，ADSC-Exos能有效下調COL1、COL3、α-SMA 等的表達，從而抑制瘢痕成纖維細胞的纖維化。

綜上所述，ADSC 通過旁分泌作用分泌ADSCExos，作用于瘢痕成纖維細胞，下調COL1、COL3和α-SMA 等的表達，這為ADSC-Exos 治療增生性瘢痕提供了新思路。然而ADSC-Exos 在增生性瘢痕中的作用，仍需進一步深入探討，以期為ADSC-Exos 對增生性瘢痕的治療應用提供更科學的依據。