響應(yīng)面法優(yōu)化東革阿里中蛋白質(zhì)的提取工藝*

張遠(yuǎn)芳，郭雨璐，王桂霞，夏娟娟，邱繼雙，劉 芳

(湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000)

東革阿里(Eurycomalongifolia)是苦木科東革阿里屬植物[1]，又稱為天然偉哥、鄉(xiāng)土人參、馬來西亞人參等，被當(dāng)?shù)匾曌鲊鴮毤壦幉闹唬饕植荚跂|南亞國家，比如印度尼西亞、馬來西亞、越南等國家，一般生長于海邊森林以及海拔在700 m以下的原生從林或者次生從林。其作為傳統(tǒng)藥材，藥用歷史悠久，東革阿里整株具極高的藥用價(jià)值，但常常以其根部入藥，東南亞民間主要用于治療男性性功能障礙[2]、抗瘧疾[3]以及抗癌[4]等，現(xiàn)代藥理研究表明，東革阿里還具有降血壓、降血糖、抗焦慮及抗骨質(zhì)疏松等多種功效[5-7]。東革阿里主要化學(xué)成分有萜類和生物堿類，除此之外還含有揮發(fā)油、甾醇、蛋白質(zhì)、木脂素等成分[8]。

蛋白質(zhì)是人體重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，其中植物蛋白較一般谷物、豆類氨基酸種類多，具有較高的食用價(jià)值，有必要進(jìn)行深入研究[9]。目前蛋白質(zhì)的提取方法工藝主要有堿提酸沉法[10]、微波法[11]、鹽溶法[12]等，其中堿提酸沉法因其成本低，操作簡便而應(yīng)用廣泛。目前，關(guān)于東革阿里的研究主要集中在生物堿類、萜類等成分及其生物活性的研究[13]，而對于東革阿里中蛋白質(zhì)的組成、功能性質(zhì)研究未見報(bào)道。因此，本文以東哥阿里為原料，采用堿提酸沉法提取東革阿里中的蛋白質(zhì)，以單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，再結(jié)合利用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為東哥阿里的綜合利用和深入開發(fā)研究提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物和主要試劑

東革阿里，購自馬來西亞藥材市場，由湘南學(xué)院劉鵬老師鑒定為苦木科東革阿里屬東革阿里，標(biāo)本保存于湘南學(xué)院的湖南省教育廳醫(yī)藥微生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(標(biāo)本編號：20130916DGAL)。酪蛋白、考馬斯亮藍(lán)，阿拉丁試劑有限公司；乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸均為分析純；水為超純水。

1.2 主要儀器

YB-2000A高速多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；752紫外可見分光光度計(jì)，上海元析分析儀器有限公司；TDZ4A-WS臺式低速離心機(jī)，濟(jì)南好來寶醫(yī)療器材有限公司；FA1604電子天平，上海精科天平儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 東革阿里粉末的制備

取東革阿里藥材切片通過鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行烘干，粉碎，過篩(60目)，得到藥材粉末，備用。

2.2 考馬斯亮藍(lán)染液配制

精確稱取50 mg考馬斯亮藍(lán)試劑，用95%乙醇溶液25 mL進(jìn)行溶解，然后加入85%的濃磷酸100 mL，蒸餾水稀釋至200 mL得儲備液，存于棕色瓶。臨用前用超純水按1:5的比例稀釋，配制成考馬斯亮藍(lán)染液。

2.3 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液的配制：準(zhǔn)確稱取75 mg酪蛋白于50 mL容量瓶中，用 0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容，得1.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，依次吸取系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液各1 mL，分別加入考馬斯亮藍(lán)染液5 mL，混勻后靜置2 min，測定在波長595 nm下的吸光度值A(chǔ)595，以酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 東革阿里蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)的測定

參考文獻(xiàn)[14]，利用蛋白質(zhì)在溶劑中溶解度最低時(shí)的pH為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)原理。如表1所示，取7支規(guī)格相同的干燥試管，分別編號，按下表順序準(zhǔn)確地加入各種試劑，加入每種試劑后混合均勻。靜置20 min，觀察每支試管溶液的渾濁度，以+、++、+++、++++、+++++表示溶液的渾濁程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4號試管最渾濁，因此測定pH=4.7為東革阿里蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。

表1 測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)情況表Table 1 Isoelectric point of Eurycoma longifolia protein

2.5 東革阿里蛋白質(zhì)提取

參考文獻(xiàn)[15]，利用堿提酸沉法提取東革阿里蛋白質(zhì)，稱取適量的東革阿里粉末按照一定料液比(1:10～1:40) g/mL加入超純水，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至(9～12)，在一定溫度(30～60 ℃)下，提取一段時(shí)間(1～2.5 h)，冷卻過濾取濾液，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至東革阿里蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，靜置12 h后，在4000 r/min的條件下離心15 min，取沉淀水洗用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，得東革阿里蛋白質(zhì)溶液。

2.6 東革阿里蛋白質(zhì)提取率的測定

采用Bradford方法對東革阿里蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行含量測定。量取“2.4”項(xiàng)下東革阿里蛋白質(zhì)溶液1 mL于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，振蕩混勻，靜置2 min，測量在595 nm下的吸光度值 A595，代入酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中的蛋白質(zhì)的濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算提取率：

東革阿里蛋白質(zhì)提取率(%)=提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/樣品的質(zhì)量×100%

2.7 單因素試驗(yàn)

以東革阿里蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，分別考察提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL)、溫度(30、40、50、60、70 ℃)， pH值(9、10、11、12)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究各因素對東革阿里蛋白質(zhì)提取率影響，確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)以進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.8 單因素實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在“2.6”項(xiàng)單因素試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)理論，選取提取時(shí)間(A)、料液比(B)、溫度(C)、pH值(D)這四個(gè)單因素為自變量，運(yùn)用軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，編碼見表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface design

3 結(jié)果與分析

3.1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve ofcasein

按照“2.3”項(xiàng)下的方法，得到酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為：A=0.1603C+0.3058(R2=0.9950)，線性范圍為0.15～1.35 mg/mL，可用于東革阿里蛋白質(zhì)含量的測定。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 提取時(shí)間對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia protein from citrus peel

由圖2可見，0.5～1.5 h之間，東革阿里蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)逐步上升，1.5～2.5 h之間，提取率逐漸下降，當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)1.5 h時(shí)，東革阿里蛋白質(zhì)提取率達(dá)最大值1.26%，再繼續(xù)增加提取時(shí)間，可能由于長時(shí)間的加熱，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致提取的蛋白量減少，降低了提取率。綜上，選取1.5 h為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

3.2.2 料液比對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3 料液比對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia protein from citrus peel

由圖3所示，隨著料液比的不斷增加，東革阿里蛋白質(zhì)提取率存在先升高后下降的趨勢，其中在1:10～1:30(g/mL)之間時(shí)，東革阿里蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的增加而顯著升高，在1:30～1:50(g/mL)之間，東革阿里蛋白質(zhì)提取率反而下降，可能原因是料液比越大，增大了提取液黏度，影響蛋白質(zhì)的溶出，導(dǎo)致不能充分提取東革阿里中的蛋白質(zhì)，降低其蛋白質(zhì)提取率，因此選擇料液比1:30(g/mL)為0水平，進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

3.2.3 溫度對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響

圖4 溫度對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia

由圖4可知，東革阿里蛋白質(zhì)提取率隨提取溫度的升高，先增大后減小，當(dāng)溫度在50 ℃時(shí)，東革阿里蛋白質(zhì)提取率最大。最初升高溫度有利于蛋白質(zhì)的擴(kuò)散、溶出，故提取率增大，而當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，可能出現(xiàn)蛋白質(zhì)受熱變性，黏度增加，或雜質(zhì)溶解度增大等，導(dǎo)致東革阿里蛋白質(zhì)提取率減小。因此選擇溫度為50 ℃進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

3.2.4 pH對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響

圖5 pH對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果Fig.5 Effect of pH on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia

由圖5所示，東革阿里蛋白質(zhì)提取率隨著pH的變化先上升后下降，于pH=11 時(shí)，東革阿里蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值1.89%，當(dāng)溶液pH>11時(shí)，東革阿里蛋白質(zhì)提取率下降，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)于強(qiáng)堿條件下溶解度較大，而當(dāng)pH>11會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)淀粉會糊化，不易于蛋白質(zhì)的溶出，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降。故選取pH為11進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化東革阿里蛋白質(zhì)提取工藝試驗(yàn)

3.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化條件設(shè)計(jì)及結(jié)果

以4個(gè)單因素為自變量，以東革阿里蛋白質(zhì)提取率的值為響應(yīng)面的響應(yīng)值，通過利用Box-Behnken方法進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3所示。

表3 東革阿里蛋白質(zhì)工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis of Eurycoma longifolia protein

3.3.2 響應(yīng)面模型的建立和分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到以提取時(shí)間、料液比、溫度、pH 為自變量，以東革阿里蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)面響應(yīng)值的二元回歸方程：

蛋白質(zhì)提取率Y=2.06+0.39A+0.093B+0.036C+0.4D+0.012AB-0.13AC+0.083AD-0.045BC-7.5×10-3BD-0.095CD-0.36A2-0.51B2-0.82C2-0.65D2

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model

根據(jù)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的方差分析，結(jié)果見表4。此模型的回歸系數(shù)R2=0.9509，決定系數(shù)RAdj2=0.9018，說明提取率的實(shí)際值與預(yù)測值在試驗(yàn)范圍內(nèi)擬合較好，該模型P<0.0001具有極顯著性，失擬誤差P=0.4266>0.05，表示失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型擬合度良好，實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)合理，對響應(yīng)面的變化具有較好的反映。通過比較各因素的F值，可依次得出對試驗(yàn)指標(biāo)影響程度的大小，依次排序?yàn)閜H(D)>提取時(shí)間(A)>料液比(B)>溫度(C)。根據(jù)P值大小，可知模型中一次項(xiàng)A、D極顯著，二次項(xiàng)A、B、C、D極顯著，交互項(xiàng)均不顯著，表明各因素之間交互效應(yīng)較弱，各因素與東革阿里蛋白質(zhì)提取率之間不是簡單的線性關(guān)系。

3.3.3 響應(yīng)面分析

通過響應(yīng)面3D圖的曲面坡度程度，直觀反映每兩個(gè)因素之間對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響程度。響應(yīng)面曲面越陡，表明兩個(gè)因素的交互作用影響越大，對響應(yīng)值的影響越大，反之影響越小。如圖6a～圖6f所示，其中pH和提取時(shí)間的曲面最陡，交互作用較明顯，對東革阿里蛋白質(zhì)提取率的影響較為顯著。

圖6 各因素交互作用對東革阿里蛋白提取率影響Fig.6 The effect of interaction of various factors on the extraction rate of Eurycoma longifolia protein

3.3.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件對東革阿里蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為：提取時(shí)間為1.8 h、料液比為1:30.99(g/mL)、溫度為49.51 ℃、pH為11，預(yù)計(jì)東革阿里蛋白質(zhì)提取率為2.25%。考慮實(shí)際的試驗(yàn)操作性，將工藝參數(shù)修正為：提取時(shí)間為1.8 h、料液比為1:30(g/mL)、溫度為50 ℃、pH為11。平行進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到蛋白質(zhì)的提取率為2.04%。該結(jié)果與模型預(yù)測值基本一致。可見，此模型適用東革阿里蛋白質(zhì)提取，方法具有可行性。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用堿提酸沉法提取東革阿里中的蛋白質(zhì)，在單因素基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，建立的模型能較好的預(yù)測東革阿里蛋白質(zhì)含量，并確定最佳提取工藝為：提取時(shí)間為1.8 h、料液比為1:30(g/mL)、溫度為50 ℃、pH為11，東革阿里中蛋白質(zhì)的提取率為2.04%。此工藝設(shè)計(jì)合理，方法簡單，重復(fù)性好，為東革阿里蛋白質(zhì)的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。