胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響

潘海春 祁大慶 陳琳慧 汪玲羽

胃癌的特征是在胃壁內(nèi)生長(zhǎng)癌細(xì)胞，雖然與其他類型的癌癥相比，胃癌相對(duì)罕見，但這種疾病最大的危險(xiǎn)因素之一是診斷困難。因?yàn)槲赴┩ǔ２粫?huì)引起任何早期癥狀，所以通常在擴(kuò)散到身體其他部位后才被確診，這使得治療更加困難[1]。中國(guó)胃癌每年新發(fā)病例約為68萬(wàn)例，占全球發(fā)病病例的一半左右，且大部分患者診斷時(shí)已為進(jìn)展期胃癌[2]。當(dāng)上消化系統(tǒng)內(nèi)正常健康的細(xì)胞發(fā)生癌變，生長(zhǎng)失控形成腫瘤時(shí)，就會(huì)發(fā)生胃癌。這個(gè)過(guò)程發(fā)生得很慢，因此胃癌往往會(huì)發(fā)展多年[3]。有很多因素可能會(huì)增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)，包括某些其他疾病，例如：淋巴瘤、幽門細(xì)菌感染、消化系統(tǒng)其他部位的腫瘤、胃息肉等[4]。晚期胃癌最常見的癥狀有：惡心嘔吐、頻繁的胃灼熱、食欲不振，有時(shí)伴有突然的體質(zhì)量減輕、持續(xù)性腹脹、早飽、血便、黃疸、過(guò)度疲勞、胃痛等[5]。胃癌的主要治療方法有：化療、放射治療、外科手術(shù)、免疫治療、疫苗和藥物治療等[6]。5-氟尿嘧啶是嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝、抗腫瘤藥，能有效抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷酸，又能干擾DNA合成，同時(shí)也一定程度的抑制RNA。臨床常用于胃癌、肝癌、直腸癌、結(jié)腸癌等的治療[7, 8]。

細(xì)胞的凋亡與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，在正常情況下,機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和ROS清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，其他外源和內(nèi)源因素誘導(dǎo)時(shí)會(huì)平衡破壞，大量的活性氧來(lái)不及清除會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性而對(duì)人體產(chǎn)生傷害，有研究表明，活性氧的氧化應(yīng)激也是胃癌凋亡的因素之一[9，10]。

胃復(fù)春膠囊是一種用于治療胃部疾病的中成藥，主要對(duì)惡心、嘔吐、反酸、噯氣、胃脹、胃痛、食欲不振等臨床癥狀有治療效果，臨床上可用于胃癌的輔助治療[11,12]。本研究通過(guò)細(xì)胞凋亡和抗氧化水平的檢測(cè)來(lái)研究胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用的相關(guān)機(jī)制，研究胃復(fù)春膠囊的提取物在胃癌中細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡的作用影響，從而為胃復(fù)春聯(lián)合抗癌藥物在胃癌的輔助治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器UV-3600Plus分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理有限公司)；厭氧工作站 Concept 1000(北京隆福佳生物科技有限公司)；DYY-6D三恒電泳儀(北京市六一儀器廠)； BD FACSCanto II 流式細(xì)胞儀(上海碧迪醫(yī)療器械有限公司)；TSX40086A 超低溫冰箱(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；W5L-1恒溫水浴槽(杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；MLS-3751L高壓蒸汽滅菌鍋(松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社)；Stab S2可疊加式全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海潤(rùn)度生物科技有限公司)Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；Eppendorf-5424小型高速離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)用藥品與試劑胃復(fù)春膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090697，杭州胡慶余堂有限公司)；5-氟尿嘧啶、DMSO、注射用青霉素鈉及注射用硫酸鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清、DMEM(美國(guó)HyClone公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibico公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)所用抗體包括Bax、Bcl-2和GAPDH(均購(gòu)買自美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Bender公司)；細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蒸餾水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得；鹽酸、碳酸氫鈉、乙醚均為分析純(購(gòu)自北京化工廠)；其他試劑(分析純)(北京試劑廠)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MGC-803購(gòu)買自美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)。將胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于PMI1640培養(yǎng)液(100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清)中，置于37 ℃濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)(含5% CO2，95%空氣)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×105個(gè)/ml密度)中，每孔1 ml，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 抑制細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)取MGC-803胃癌細(xì)胞(1×105/ml)分別接種于96孔板(200 μl/孔)，每孔加入終濃度為0、50、100、200 nmol/L的5-氟尿嘧啶或0、50、100、200 μg/ml的胃復(fù)春膠囊提取物。以同體積PMI1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照。各質(zhì)量濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去藥液，在37 ℃下每孔加入MTT試劑100 μl，繼續(xù)孵育4 h，用分光光度計(jì)在OD=590 nm處測(cè)定各孔吸光度值(A)。空白對(duì)照組細(xì)胞的活力計(jì)為100%，計(jì)算各處理組細(xì)胞的相對(duì)活力(×100%)。以細(xì)胞活力下降到對(duì)照的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥品濃度計(jì)為半抑制濃度(IC50)。

1.3.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期將MGC-803胃癌細(xì)胞(1×105/ml)接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別加入0、50、100、200 μg/ml的胃復(fù)春膠囊提取物和終濃度為50 nmol/L的5-氟尿嘧啶，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集并離心，再加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，篩網(wǎng)過(guò)濾后送流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。另取各孔細(xì)胞，PBS洗滌2次，用冰浴預(yù)冷的70%乙醇于4 ℃固定24 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，避光染色30 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量的變化MGC-803細(xì)胞以50 nmol/L的5-氟尿嘧啶、100 μg/ml的胃復(fù)春膠囊提取物處理24 h后，收集細(xì)胞，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞漿蛋白抽提操作，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以GAPDH分別作為內(nèi)參，然后ECL發(fā)光液顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.3.5 細(xì)胞SOD MDA和GSH-Px測(cè)定50 nmol/L的5-氟尿嘧啶、100 μg/ml的胃復(fù)春膠囊提取物MGC-803細(xì)胞處理24 h后，按組別收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按MDA、SOD、GSH-Px試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的MDA、SOD、GSH-Px含量。

2 結(jié)果

2.1 5-氟尿嘧啶及胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響不同濃度的5-氟尿嘧啶處理細(xì)胞24 h后，MGC-803細(xì)胞株活力顯著降低，并具有濃度依賴性，其中50 nmol/L的5-氟尿嘧啶處理后，細(xì)胞活力大約下降了50%，其半抑制濃度為51.25 nmol/L。見表1。經(jīng)過(guò)50 nmol/L的5-氟尿嘧啶和不同濃度胃復(fù)春膠囊提取物共同處理24 h、48 h、72 h后，MGC-803細(xì)胞株活力均有所下降，且隨著胃復(fù)春膠囊提取物濃度的升高和處理時(shí)間的增加，同步對(duì)細(xì)胞活力的下降作用也逐漸增強(qiáng)，呈濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。見表2。

表1 5-氟尿嘧啶對(duì)MGC-803細(xì)胞活力的影響

表2 胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)5-氟尿嘧啶處理的胃癌細(xì)胞活力的影響

2.2 胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，胃復(fù)春膠囊提取物能抑制胃癌細(xì)胞凋亡。胃復(fù)春膠囊提取物(終濃度為100μg/ml)處理胃癌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)為23.70%，5-氟尿嘧啶(50 nmol/L)處理的細(xì)胞凋亡率為20.33%。5-氟尿嘧啶和胃復(fù)春膠囊提取物共同處理的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率顯著增加，達(dá)到43.02%，明顯高于5-氟尿嘧啶單獨(dú)處理組。見圖1。

圖1 胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

2.3 5-氟尿嘧啶及胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)量的影響通過(guò)Western blot測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)5-氟尿嘧啶處理后MGC-803細(xì)胞中，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)量上調(diào)；在胃復(fù)春膠囊與5-氟尿嘧啶組，胃癌細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)量隨著劑量增加持續(xù)上調(diào)。見圖2。

圖2 胃復(fù)春膠囊提取物及5-氟尿嘧啶聯(lián)用對(duì)與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

2.4 5-氟尿嘧啶及胃復(fù)春膠囊提取物對(duì)胃癌細(xì)胞中SOD MDA和GSH-Px的影響與對(duì)照組培養(yǎng)細(xì)胞上清液比較，采用黃嘌呤氧化酶法于550 nm處對(duì)SOD活力的測(cè)定結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶處理使胃癌細(xì)胞中SOD酶活性有所降低(P>0.05)，胃復(fù)春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯(lián)用處理組胃癌細(xì)胞SOD酶活性降低比較明顯(P<0.05)；采用TBA法(532 nm)測(cè)定MDA含量的結(jié)果顯示：5-氟尿嘧啶處理使胃癌細(xì)胞中MDA含量明顯升高，胃復(fù)春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯(lián)用處理組MDA含量明顯升高(P<0.05)；5-氟尿嘧啶處理使胃癌細(xì)胞中GSH-Px活性顯著降低，而胃復(fù)春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯(lián)用處理后細(xì)胞上清液中GSH-Px活性進(jìn)一步降低(P<0.05)。見表3。

表3 胃復(fù)春膠囊提取物及5-氟尿嘧啶聯(lián)用對(duì)胃癌細(xì)胞中SOD MDA和GSH-Px的影響 (n=5)

3 討論

腹部腫瘤可能是一個(gè)嚴(yán)重的威脅生命的問(wèn)題。事實(shí)上，胃癌是最致命的癌癥之一，這主要是因?yàn)橹钡郊膊“l(fā)展到相當(dāng)嚴(yán)重時(shí)才出現(xiàn)明顯的癥狀。目前，手術(shù)、化療和放療是胃癌最常見的治療方法。胃癌手術(shù)可能需要切除全部或部分胃，附近的淋巴結(jié)也可能需要切除。切除部分胃的手術(shù)可能會(huì)緩解晚期胃癌患者的癌癥癥狀和體征。化療是一種利用化學(xué)物質(zhì)殺死癌細(xì)胞的藥物治療。化療藥物遍布全身，殺死可能擴(kuò)散到胃以外的癌細(xì)胞[13]。5-氟尿嘧啶雖然臨床應(yīng)用很多，但是也有大量的不良作用，例如：胃腸道反應(yīng)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)腹痛、惡心嘔吐、食欲不振等癥狀，嚴(yán)重者有血性腹瀉或便血。此外還有骨髓抑制、脫發(fā)、皮膚和指甲色素沉著等[14]。與化療藥物相比，天然產(chǎn)物在胃癌的治療中具有安全性高、不良作用小的優(yōu)點(diǎn)。目前已報(bào)道了多種具抗腫瘤作用的天然產(chǎn)物對(duì)胃癌的作用，包括在體外對(duì)胃癌細(xì)胞系的研究或在體內(nèi)對(duì)胃癌動(dòng)物模型的研究，也有少量的臨床試驗(yàn)[15]。許多天然化合物可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡而抑制胃癌生長(zhǎng)。天然物質(zhì)的另一用途是聯(lián)合療法，即2種或2種以上的物質(zhì)或一種天然產(chǎn)物與常規(guī)化療藥物聯(lián)合用藥。一些天然化合物可能對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞毒療法敏感，增強(qiáng)藥物的有效濃度，增強(qiáng)2種藥物的聯(lián)合作用或?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒作用。此外，通過(guò)靶向多種信號(hào)通路的聯(lián)合治療，利用各種機(jī)制來(lái)減少抗腫瘤藥物的耐藥性[16]。胃復(fù)春是中藥復(fù)方制劑，臨床上主要用于防治慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變，已有多年應(yīng)用的歷史。但是胃復(fù)春治療胃癌癌前病變的作用機(jī)制尚不明確。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是以核DNA斷裂為標(biāo)志的細(xì)胞自我毀滅的遺傳導(dǎo)向過(guò)程，通過(guò)刺激物的存在或抑制劑或刺激物的去除而被激活，是消除DNA受損、多余或不需要的細(xì)胞的正常生理過(guò)程，當(dāng)停止(如基因突變)可能導(dǎo)致細(xì)胞異形增生和腫瘤形成，故又稱為程序性細(xì)胞死亡(PCD)，細(xì)胞凋亡是人體的本身具有的生理機(jī)制，在人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶可引起MGC-803細(xì)胞凋亡，而不同濃度的胃復(fù)春膠囊提取物可以促進(jìn)由5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)引起的細(xì)胞凋亡，表明胃復(fù)春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯(lián)用，可以促進(jìn)5-氟尿嘧啶致凋亡的作用。

據(jù)報(bào)道在細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bcl-2家族蛋白的激活也起到重要作用[19]。胃復(fù)春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯(lián)用處理的MGC-803細(xì)胞中可以進(jìn)一步上調(diào)Bax的表達(dá)量，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)量。猜測(cè)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白活性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)表明機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是ROS的產(chǎn)生和清除處在失衡狀態(tài)的表現(xiàn)[20]。此次研究中發(fā)現(xiàn)胃復(fù)春膠囊提取物增強(qiáng)氧化應(yīng)激水平，對(duì)5-氟尿嘧啶處理的胃癌細(xì)胞的促進(jìn)凋亡作用可能與它的氧化還原功能有關(guān)。

綜上所述，在5-氟尿嘧啶處理的胃癌細(xì)胞中，胃復(fù)春膠囊的提取物可以對(duì)抗凋亡蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，對(duì)促凋亡蛋白分子進(jìn)行增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。此次研究的結(jié)果對(duì)胃復(fù)春膠囊進(jìn)一步研究對(duì)胃癌術(shù)后的輔助作用提供理論依據(jù)。