體液piRNA作為疾病潛在生物標志物的研究進展

鄔燕倩，俞 翀，沈 鷺，鄭浩然，洪葉挺

（1.杭州醫學院檢驗醫學院生物工程學院，浙江 杭州 311300；2.浙江省人民醫院泌尿外科，浙江 杭州 310014；3.溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學院，浙江 溫州 325035）

隨著現代醫學的快速發展，篩選出高特異性和高靈敏度的生物標志物，實現對疾病的快速、精準診斷，是目前醫學研究的一個重要方向。體液細胞外RNA（extracellular RNA，exRNA）具有成為新型生物標志物的可能。有研究發現，PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）可穩定地存在于血液（血清、血漿）、尿液、唾液、精液等體液中。在病理狀態下，體液中piRNA出現顯著的差異表達，而這些差異表達的piRNA可作為一種潛在的新型生物標志物，用于疾病的預測、診斷和預后。本文就各種疾病狀態下，人體液中piRNA的差異表達作一綜述。

1 piRNA的結構與功能

piRNA是從動物生殖細胞中分離得到的一類與生殖細胞發育相關的新型內源性非編碼小RNA[1-2]，具有動物特異性，長度為24～33 nt。在結構上，大部分piRNA以單鏈形式存在，其5'端第1位具有單磷酸化和尿嘧啶偏好性，3'末端有2'-O-甲基化修飾，并與Argonaute蛋白家族中的PIWI蛋白相互作用[3]。有研究發現，piRNA在沉默轉座子、調節基因表達及抵抗病毒感染中發揮著重要作用[4]。piRNA與PIWI蛋白結合形成piRNA-PIWI復合物，通過抑制轉座子的跳躍、調控表觀遺傳和介導mRNA的翻譯等形式參與調控精子的發生和腫瘤等疾病的發生、發展[5-6]。

2 體液piRNA的發現和來源

2013年，HUANG等[7]對血漿外泌體中的RNA進行測序，發現血漿外泌體中存在piRNA。2016年，FREEDMAN等[8]和YUAN等[9]發現血漿中穩定存在piRNA。FREEDMAN等[8]通過測序和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析了血漿中的RNA，發現血漿中普遍存在piRNA。YUAN等[9]對50名健康對照者和142名癌癥患者（結直腸癌、前列腺癌和胰腺癌）的血漿外囊泡進行了RNA測序，發現血漿外囊泡中穩定存在大量piRNA。BAHN等[10]通過二代測序發現唾液中存在piRNA。HONG等[11]采用RNA測序發現精漿中存在大量piRNA。EL-MOGY等[12]采用二代測序對不同體液（全血、血漿、血清、唾液、無細胞唾液、尿液和無細胞尿液）中的RNA進行分析，發現piRNA在各種體液中均有表達。目前已知piRNA的分泌主要有2種形式：一種是游離的piRNA，直接由細胞分泌；另一種是piRNA被選擇性地包裹在外泌體和微小體等膜性結構中，然后由細胞分泌進入體液[13]。

3 體液piRNA作為診斷疾病的潛在生物標志物的價值

piRNA 3'端的特異性甲基化修飾提示piRNA在體液中比較穩定。有研究結果顯示，piRNA無論是反復凍融還是室溫保存都比較穩定[11]。此外，體液中的piRNA在特定疾病狀態下會出現差異表達。因此，體液中piRNA有作為新型生物標志物的潛能。

3.1 外周血中piRNA在不同疾病中的差異表達

3.1.1 消化系統腫瘤患者外周血中piRNA的差異表達 消化系統腫瘤主要包括胃癌、結直腸癌、胰腺癌、膽囊癌等，此類患者外周血中piRNA的表達與腫瘤的發生、發展密切相關。CUI等[14]發現胃癌患者外周血piR-651和piR-823表達顯著低于健康對照者（P＜0.001），且外周血piR-823水平與腫瘤TNM分期和轉移呈正相關（P值分別為0.027、0.026），提示piRNA有作為胃癌發生、發展評估指標的潛力。GU等[15]的研究結果顯示，膽管癌和膽囊癌患者血漿外泌體piR-10506469表達顯著升高，術后血漿外泌體piR-10506469和piR-20548188表達顯著降低，提示血漿外泌體中差異表達的piRNA可作為膽管癌和膽囊癌輔助診斷及術后評估的潛在生物標志物。另外，piRNA還被認為是結直腸癌篩查、診斷和預后評估的潛在生物標志物。有研究結果顯示，piR-28876和 piR-5937診斷結腸癌具有較高的敏感性（75.0%、72.0%）和特異性（70.0%、72.5%），與癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，CA19-9）相比，piRNA診斷結腸癌具有更高的敏感性，且piRNA與CEA、CA-199聯合檢測的診斷敏感性更高（86%）[16]。QU等[17]在結直腸癌患者血清中鑒定出5種差異表達的piRNA（piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365），可用于結直腸癌的輔助診斷并發現piR-017724還可作為結腸癌患者預后評估的生物標志物。MAI等[18-19]的研究結果顯示，在結直腸癌患者中，piR-54265具有致癌作用，其血清水平與腫瘤組織水平呈正相關（r=0.53，P＜0.001）；進一步研究發現，血清piR-54265可作為結直腸癌早期診斷的生物標志物（敏感性為85.7%，特異性為65.1%）；患者術后血清piR-54265水平顯著降低（P=0.000 5），復發時會再次顯著增高（P=0.014），表明血清piR-54265可作為結直腸癌篩查、早期診斷和預后評估的潛在的生物標志物。piR-823已被證明在多種癌癥中表達失調，是多種癌癥診斷和預后的潛在生物標志物[5]。SABBAH等[20]發現，結直腸癌患者血清和癌組織中piR-823表達顯著升高，其血清水平與結直腸癌分期呈正相關（P＜0.001），尤其在晚期（TNM分期Ⅲ～Ⅳ期）結直腸癌患者中，piR-823水平顯著升高。WANG等[21]的研究結果顯示，結直腸患者血清piR-020619和piR-020450表達顯著上調，與結直腸癌TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期）有關，或可作為早期結直腸癌潛在的新型生物標志物。

3.1.2 血液系統疾病患者外周血中piRNA的差異表達 CORDEIRO等[22]的研究結果顯示，霍奇金淋巴瘤患者血清piR-651表達量顯著降低，且與無進展生存期和總生存期相關，在治療完全緩解后，血清piR-651表達量上升至健康人的水平。YAN等[23]的研究結果顯示，多發性骨髓瘤患者骨髓piR-823表達量明顯高于健康對照者（P＜0.01），piR-823的表達上調導致DNA甲基轉移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）和DNA甲基轉移酶3B（DNA methyltransferase 3B，DNMT3B）表達量顯著升高，促使DNA高甲基化，沉默腫瘤抑制基因的表達，進而導致多發性骨髓瘤的發生、發展。LI等[24]的研究結果顯示，多發性骨髓瘤患者外周血外囊泡中piR-823呈高表達，且與腫瘤分期晚期及不良預后有關，提示外囊泡中的piR-823可作為多發性骨髓瘤診斷和預后的潛在生物標志物；另外，他們進一步的機制研究發現piR-823可伴隨多發性骨髓瘤細胞分泌的外泌體傳遞到內皮細胞中，促進內皮細胞增殖，促進血管生成，進而促進腫瘤的發生、發展。有研究結果顯示，多發性骨髓瘤患者骨髓上清液外泌體中的piR-004800表達量顯著升高，且與多發性骨髓瘤的分期呈正相關[25]。由此可見，piRNA與霍奇金淋巴瘤和多發性骨髓瘤的發生、發展密切相關。

3.1.3 其他疾病患者外周血中piRNA的差異表達 YANG等[26]發現，心力衰竭患者血清外泌體中piRNA存在差異表達，其中piR-020009和piR-006426下調最顯著，提示piRNA或可作為心力衰竭潛在的生物標志物。SUNDAR等[27]系統分析了吸煙者、慢性阻塞性肺疾病患者和非吸煙者血漿外囊泡中的小RNA表達譜，結果顯示，piR-012753在慢性阻塞性肺疾病組與非吸煙組之間有明顯差異；piR-016735在吸煙組與慢性阻塞性肺疾病組之間存在明顯差異。JIA等[28]分析了非綜合征型唇腭裂患者血漿外泌體中的piRNA表達譜，鑒定出3種可作為非綜合征型唇腭裂產前診斷生物標志物的piRNA（piR-009228、piR-016659、piR-020496）。SABO等[29]的研究結果顯示，膀胱癌患者血漿外泌體中的piR-5936表達量隨病情嚴重程度的增加而升高。KUMAR等[30]發現，男性不育組血清piR-26399水平顯著高于健康對照組（P=0.032），提示血清piR-26399可作為男性不育的潛在生物標志物。

總之，piRNA可以穩定存在于外周血中，且在特定的病理生理狀態下會呈現顯著的差異表達，提示外周血piRNA具有作為疾病新型生物標志物的潛力。

3.2 精液piRNA在男性不育狀態下的差異表達

2014年，VOJTECH等[31]首先報道在精漿外泌體中存在piRNA。2016年，HONG等[11]系統分析了正常對照者、弱精癥患者和無精癥患者精漿piRNA的表達譜，發現男性不育組精漿piRNA的種類和含量均顯著減少和降低，大樣本量驗證結果顯示，弱精癥和無精癥患者精漿中有5種piRNA（piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198）含量顯著下降，這5種piRNA可以作為弱精癥、無精癥輔助診斷的潛在的新型生物標志物。2021年，HONG等[13]又對精漿中差異表達最顯著的piR-1207（piR-31068）和piR-2107（piR-31925）進行分析，結果顯示，piR-1207和piR-2107主要分布于精漿外泌體中，且弱精癥患者精漿外泌體中的含量顯著降低。CHEN等[32]分析了非梗阻性無精癥患者中成功取到精子組和未成功取到精子組精漿外囊泡中的小RNA表達譜，結果顯示，有8個piRNA在成功取到精子組和未成功取到精子組之間存在顯著差異，其中piR-61927可作為判斷非梗阻性無精癥患者能否成功取到精子的潛在的生物標志物。piRNA主要表達于生殖細胞，其對于沉默生殖細胞基因組轉座元件和調控生殖細胞基因表達至關重要，而piRNA的異常表達也被認為是男性不育的潛在原因[33]。因此，精漿piRNA的特異性表達可作為輔助診斷男性不育等疾病的潛在生物標志物。

3.3 尿液中piRNA在疾病狀態下的差異表達

ILIEV等[34]的研究結果顯示，腎細胞腎癌患者尿液piR-823表達顯著高于對照者（P=0.015 6），其診斷腎細胞腎癌的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積為0.74，表明尿液piR-823對于腎細胞腎癌有較好的輔助診斷價值。MARKERT等[35]發現尿液piR-018849和piR-019324可用于鑒別前列腺癌和前列腺增生。由此可見，特異性表達的piRNA有助于腎臟、泌尿系統疾病的輔助診斷和病情監測。

3.4 唾液piRNA在疾病狀態下的差異表達

唾液是最易獲取且無創的體液。唾液中的小RNA，如微小RNA（microRNA，miRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）、轉移RNA衍生的小RNA（tRNA-derived small RNA，tsRNA）可作為多種疾病潛在的生物標志物[36-38]。BAHN等[10]證實唾液中piRNA含量豐富，且主要位于外泌體中，并提示唾液piRNA可能來源于唾液腺、口腔黏膜等。因此，唾液中的piRNA或可作為口腔疾病潛在的生物標志物。

4 總結和展望

目前，關于不同體液中的piRNA是否可作為疾病早期診斷和預后評估標志物的研究已有一定的進展。體液中鑒定出的piRNA已展現出作為多種疾病早期診斷和預后評估生物標志物的潛力，見表1。但目前相關研究涉及的疾病種類和數量還相對較少，體液piRNA識別和量化也無統一的方法，不同方法得出的檢測結果之間存在一定的差異，對于體液piRNA的研究尚處于初始階段。

表1 體液piRNA在不同疾病中的表達及臨床價值

隨著體液中外囊泡分離以及核酸測序和定量檢測技術的不斷發展，體液piRNA的數據庫會日益完善，piRNA的種類及含量會被精準識別和定量，同時，體液中piRNA水平的診斷標準也會被統一。相信隨著分子診斷技術的快速發展和piRNA分子機制研究的深入，體液piRNA極有可能發展成為一種疾病預防、早期診斷和預后評估的新型生物標志物。