亞麻籽炒籽過(guò)程美拉德反應(yīng)底物變化及其模擬體系產(chǎn)物的抗氧化活性

杜 玥 ，熊 倩 ，李可瑤 ，李 穎 ，蔡子哲 ，汪 勇

(1.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣州 510632; 2.廣東省油料生物煉制與營(yíng)養(yǎng)安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，廣州 510632)

亞麻是我國(guó)的八大油料作物之一，主要產(chǎn)地為西北地區(qū)[1-2]。亞麻籽，為亞麻(LinumusitatissimumL.)的成熟種子。亞麻籽由于富含油脂和木酚素、環(huán)肽、多糖等營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的功效成分而廣受消費(fèi)者的喜愛(ài)。近年來(lái)，亞麻籽市場(chǎng)逐漸壯大，2020年亞麻籽進(jìn)口量達(dá)37.3萬(wàn)t[3]。亞麻籽油是市面上最主要的亞麻籽產(chǎn)品，熱榨亞麻籽油是西北當(dāng)?shù)鼐用竦娜粘Ｊ秤糜汀２捎脽嵴スに囍苽鋪喡樽延统丝梢蕴岣叱鲇吐省⒃鰪?qiáng)油脂風(fēng)味外，還可以進(jìn)一步使油料中潛在具有抗氧化活性的脂質(zhì)伴隨物(如多酚、植物甾醇等)進(jìn)入原油。與此同時(shí)，炒籽過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)也是引起亞麻籽油色澤加深、風(fēng)味增強(qiáng)、氧化穩(wěn)定性更好等一系列變化的重要原因[4]。美拉德反應(yīng)又稱(chēng)“非酶褐變反應(yīng)”，是羰基化合物(主要是還原糖)和氨基化合物(氨基酸、多肽和蛋白質(zhì))之間非酶反應(yīng)。研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)不僅具有抗癌、抗菌、抗氧化等生理活性[5-7]，更是在食品體系中表現(xiàn)出很好的抗氧化能力和增強(qiáng)風(fēng)味能力[8]。余蓋文等[9]研究發(fā)現(xiàn)亞麻籽適度炒籽后可以使亞麻籽油香味濃郁，并可以提高其DPPH自由基清除能力；Suri等[10]發(fā)現(xiàn)在180℃下干炒黑孜然籽(NigellasativaL.)10 min，所制油樣的氧化穩(wěn)定性更好；Qin等[11]發(fā)現(xiàn)由木糖和芝麻蛋白制備的MRPs不僅可以提高芝麻油的氧化穩(wěn)定性，還可以減少芝麻油本身生育酚的損失。目前看來(lái)，熱榨亞麻籽油氧化穩(wěn)定性較好的原因可能與亞麻籽自身含有的還原糖和氨基酸在高溫炒籽后生成的MRPs進(jìn)入油中有關(guān)。但對(duì)于熱榨亞麻籽油中可能發(fā)生美拉德反應(yīng)的底物以及不同底物反應(yīng)體系MRPs抗氧化效果的差別，并未見(jiàn)系統(tǒng)性研究。

本文通過(guò)比較不同炒籽條件下亞麻籽油的全氧化值，篩選出最優(yōu)炒籽條件，探究炒籽前后亞麻籽脫脂粉中氨基酸和還原糖變化，確定美拉德反應(yīng)的潛在底物；然后構(gòu)建各類(lèi)還原糖-氨基酸模擬反應(yīng)體系，評(píng)價(jià)不同體系MRPs的抗氧化活性，確定最優(yōu)模擬體系條件；最終通過(guò)在冷榨亞麻籽油中添加MRPs，進(jìn)一步研究最優(yōu)模擬體系條件制備的MRPs對(duì)亞麻籽油氧化穩(wěn)定性的影響，以期為亞麻籽加工條件優(yōu)化提供相關(guān)數(shù)據(jù)支持，并為后續(xù)熱榨亞麻籽油中高抗氧化活性MRPs的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

寧亞21號(hào)亞麻籽，寧夏君星坊公司提供；木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物有限公司；葡萄糖、果糖、半乳糖、精氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、丙氨酸、亮氨酸，純度98.0%，麥克林生物有限公司；氘代氯仿，上海百靈威科技有限公司；無(wú)水乙醇、正己烷、氫氧化鉀、磺基水楊酸溶液、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、異辛烷、p-茴香胺，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Gene Café干熱烘焙機(jī)；磁力攪拌器，美國(guó)塞洛捷克公司；UV-9600 紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Seven Compact pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；Avance 600 M高場(chǎng)核磁共振儀，美國(guó)布魯克公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀，日立高新技術(shù)公司；ICS 5000+離子色譜儀(配四元梯度泵,脈沖安培檢測(cè)器)，美國(guó)Thermo Fisher公司；YJY-Z200螺旋榨油機(jī)，湖北益加益機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽油樣的制備

亞麻籽油：稱(chēng)取亞麻籽約 200 g，用干熱烘焙機(jī)在120、140、160、180、200℃條件下分別旋轉(zhuǎn)干炒10、20、30 min后，粉碎，加入正己烷(固液比1∶6)過(guò)夜浸提，抽濾、離心后取上清液，在40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除正己烷后得到亞麻籽油，于-20℃冰箱儲(chǔ)藏。

冷榨亞麻籽油：稱(chēng)取亞麻籽約1 000 g，在室溫下直接用螺旋榨油機(jī)壓榨制油，將原油離心除去雜質(zhì)后得到冷榨亞麻籽油，于-20℃冰箱儲(chǔ)藏。

1.2.2 亞麻籽脫脂粉的制備

將炒籽前后亞麻籽粉碎后加入正己烷過(guò)夜浸提，抽濾，取抽濾后固體，再次采用正己烷索氏提取進(jìn)一步脫脂，常溫晾干，得到亞麻籽脫脂粉。

1.2.3 MRPs 的制備

分別稱(chēng)取一定質(zhì)量的氨基酸和還原糖至容量瓶中，添加適量磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH 7.4),調(diào)節(jié)pH至7.0。按一定比例將不同的氨基酸和還原糖溶液混合，配制不同類(lèi)型的氨基酸-還原糖反應(yīng)體系(還原糖濃度為0.1 mol/L)；將溶液放置油浴鍋中在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液迅速冷卻至室溫，凍干后放入干燥器。

1.2.4 亞麻籽油氧化穩(wěn)定性測(cè)定

采用Schaal烘箱法，將亞麻籽油及添加了MRPs的冷榨亞麻籽油放置于(60 ± 1)℃的烘箱中加速氧化，每2 d取1次油樣，測(cè)定氧化指標(biāo)。

1.2.5 亞麻籽油氧化指標(biāo)的測(cè)定

過(guò)氧化值的測(cè)定，參照GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》第一法；p-茴香胺值的測(cè)定，參照GB/T 24304—2009《動(dòng)植物油脂 茴香胺值的測(cè)定》；全氧化值按照公式(1)計(jì)算[12]。

VT=4VP+VA

(1)

式中：VT為全氧化值；VP為過(guò)氧化值，mmol/kg；VA為p-茴香胺值。

醛類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定：采用核磁共振氫譜法測(cè)定。移取50 μL亞麻籽油于直徑5 mm核磁管中，加入500 μL氘代氯仿溶解，混合均勻后，用高場(chǎng)核磁共振儀采集不同樣品的氫譜數(shù)據(jù)，以觀(guān)測(cè)亞麻籽油中次級(jí)氧化產(chǎn)物醛類(lèi)物質(zhì)含量的變化。高場(chǎng)核磁共振儀的參數(shù)[13]：頻率400 MHz及以上，光譜寬度5 000 Hz，弛豫時(shí)間3 s，掃描次數(shù)64 次，采集時(shí)間3.744 s，脈沖寬度90°，總采集時(shí)間12.9 min，溫度25℃。

1.2.6 亞麻籽脫脂粉還原糖含量的測(cè)定

采用離子色譜儀通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法對(duì)樣品中還原糖含量進(jìn)行測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別稱(chēng)取一定質(zhì)量的葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解并定容至10 mg/mL，冷藏儲(chǔ)存。用移液槍準(zhǔn)確移取一定量上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加去離子水逐級(jí)稀釋至8、10、20、30、40 μg/mL，作為系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品處理：分別稱(chēng)取0.3 g炒籽前后的亞麻籽脫脂粉至15 mL離心管中，加入10 mL 75%的乙醇溶液，磁力攪拌器常溫提取20 min，超聲提取10 min，離心后收集上清液，重復(fù)提取3 次。將提取液旋干后用去離子水配制成一定質(zhì)量濃度的樣品溶液，過(guò)0.22 μm水系濾膜后，進(jìn)離子色譜儀測(cè)定。

色譜分析條件：CarboPac PA10分析柱(4 mm×250 mm)，CarboPac PA1保護(hù)柱(4 mm×50 mm)；ED電化學(xué)檢測(cè)器；流動(dòng)相A相為純水，B相為200 mmol/L的NaOH溶液，流速0.8 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.7 亞麻籽脫脂粉游離氨基酸含量的測(cè)定

參照GB 5009.124—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定游離氨基酸含量。稱(chēng)取0.1 g亞麻籽脫脂粉，加入2 mL 5%磺基水楊酸溶液，60℃水浴浸提20 min，取出，離心過(guò)濾后進(jìn)全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。

分析條件：日立855-4507型色譜柱；色譜柱溫度57℃；反應(yīng)柱溫度135℃；檸檬酸(鋰)PF緩沖液梯度洗脫；第1通道檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm；第2通道檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量20 μL；洗脫泵流速0.35 mL/min，衍生泵流速0.30 mL/min；分析時(shí)間148 min。

1.2.8 MRPs抗氧化活性分析

將MRPs用去離子水稀釋至不同梯度濃度后，將其與0.2 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液按1∶1比例混勻后放置暗處反應(yīng)30 min，測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)下的吸光值，并按照公式(2)計(jì)算MRPs的DPPH自由基清除率(y)。

(2)

式中：A1為 2 mL DPPH溶液 + 2 mL 樣品溶液在 517 nm 波長(zhǎng)處的吸光值；A0為 2 mL 無(wú)水乙醇 + 2 mL 樣品溶液在 517 nm 波長(zhǎng)處的吸光值；A為 2 mL DPPH溶液+2 mL 去離子水在 517 nm 波長(zhǎng)處的吸光值。

1.2.9 美拉德反應(yīng)進(jìn)程指標(biāo)的測(cè)定

作為語(yǔ)言的載體，情感需要通過(guò)語(yǔ)言來(lái)表達(dá)，在廣播電視節(jié)目中，主持人的真情流露往往能獲得良好的藝術(shù)效果。情感的表達(dá)要注重真實(shí)性，不能隨意釋放自己的情感，要考慮觀(guān)眾的感受，適當(dāng)利用情感調(diào)節(jié)節(jié)目氣氛，減輕觀(guān)眾的思想包袱。在情感表達(dá)時(shí)，主持人要把握好尺度，控制好自己的情緒，從而為整體節(jié)目效果的提升做好準(zhǔn)備。

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g MRPs溶于20 mL去離子水中，配制MRPs溶液。將上述溶液用去離子水稀釋100倍后，測(cè)其在420 nm波長(zhǎng)下的吸光值，表征美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物(類(lèi)黑精)的積累量；將上述溶液用去離子水稀釋20倍后，測(cè)其在294 nm波長(zhǎng)下的吸光值，表征美拉德反應(yīng)形成的無(wú)色、無(wú)熒光(如糖、醛和二羰基化合物等)中間產(chǎn)物的積累量；用pH計(jì)測(cè)定不同反應(yīng)條件下MRPs的pH。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同炒籽條件下亞麻籽油的氧化穩(wěn)定性

亞麻籽油含有大量的不飽和脂肪酸，在用Rancimat法考察其氧化穩(wěn)定性時(shí)測(cè)得的氧化誘導(dǎo)時(shí)間較短，不能顯示不同炒籽條件下亞麻籽油氧化穩(wěn)定性的差異性。因此，選用Schaal烘箱法加速氧化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定亞麻籽油的全氧化值及醛類(lèi)物質(zhì)含量，探究不同炒籽條件下的亞麻籽油氧化穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同炒籽條件下亞麻籽油60℃加速氧化20 d后的氧化穩(wěn)定性

過(guò)氧化值表征的是氫過(guò)氧化物的含量，為評(píng)定油脂氧化初期品質(zhì)的重要指標(biāo)；p-茴香胺值表征的則是氫過(guò)氧化物進(jìn)一步氧化后生成的小分子醛酮類(lèi)次級(jí)氧化產(chǎn)物(α、β-不飽和醛類(lèi))的含量；全氧化值是將p-茴香胺值和過(guò)氧化值綜合來(lái)看，更能反映油脂的整體質(zhì)量[14]。由表2可看出：在炒籽時(shí)間為10 min時(shí)，炒籽溫度從120℃上升至140℃，全氧化值從254.69增長(zhǎng)到264.15，推測(cè)可能是由于炒籽程度較輕，生成具有抗氧化活性的MRPs少，起到的抗氧化效果有限；炒籽10、20、30 min時(shí)，亞麻籽油的全氧化值呈下降趨勢(shì)溫度區(qū)間分別為140～200℃、120～180℃以及120 ～160℃，可以初步推斷隨著炒籽程度的加劇，生成的MRPs含量較高，亞麻籽油的氧化穩(wěn)定性也隨之提高；當(dāng)炒籽20 min時(shí)，炒籽溫度從180℃上升至200℃，以及炒籽30 min時(shí)，炒籽溫度從160℃上升至200℃，亞麻籽油的全氧化值呈上升趨勢(shì)。楊金娥等[15]也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象，烤籽溫度上升到160℃以上，亞麻籽油的過(guò)氧化值急劇上升。由于MRPs在亞麻籽油中的溶解度有限，所以適度炒籽對(duì)亞麻籽油的氧化穩(wěn)定性有積極影響。炒籽條件為180℃、20 min時(shí)，亞麻籽油的全氧化值處于最低水平。

評(píng)價(jià)亞麻籽油次級(jí)氧化產(chǎn)物含量除了p-茴香胺值，還有硫代巴比妥酸(TBARS)值等方法，但均存在一定局限性，如目標(biāo)產(chǎn)物種類(lèi)有限、存在假陽(yáng)性反應(yīng)等情況。而核磁共振氫譜法，通過(guò)對(duì)次級(jí)氧化產(chǎn)物的質(zhì)子信號(hào)進(jìn)行積分后，可對(duì)其相對(duì)于甘油三酯的含量進(jìn)行測(cè)定，具有快捷、高效、所需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。在本研究所獲得的核磁共振氫譜中，多不飽和脂肪酸分子重排形成含過(guò)氧化基團(tuán)的共軛雙烯信號(hào)并不明顯，低于檢出限，表明亞麻籽油形成的過(guò)氧化物在加速氧化過(guò)程中迅速被進(jìn)一步氧化，形成次級(jí)氧化產(chǎn)物，這與Guillen等[13]報(bào)道的橄欖油氧化過(guò)程的現(xiàn)象相符。本研究采用核磁共振氫譜法測(cè)定的次級(jí)氧化產(chǎn)物主要有n-烷醛、反-2-烯醛、反，反-2,4-二烯醛，其中：n-烷醛的化學(xué)位移在9.75處，可能為飽和、不飽和酰基過(guò)氧化產(chǎn)物斷裂形成；反-2-烯醛的化學(xué)位移在9.49處，可能由單、多不飽和酰基鏈斷裂形成；而反，反-2,4-二烯醛的化學(xué)位移在9.52處，形成的主要底物為亞麻酸酰基鏈。p-茴香胺值反映的是次級(jí)氧化產(chǎn)物中不揮發(fā)性的α、β-不飽和醛，即能被核磁氫譜方法檢測(cè)到的反-2-烯醛和反，反-2,4-二烯醛。從表2可以看出，n-烷醛、反-2-烯醛、反，反-2,4-二烯醛及總?cè)┖亢腿趸底兓厔?shì)基本相同。綜合來(lái)看，炒籽條件為180℃、20 min獲得的亞麻籽油的醛類(lèi)物質(zhì)含量最低，且氧化穩(wěn)定性最好。后續(xù)研究將通過(guò)比較該條件下炒籽前后亞麻籽脫脂粉中還原糖及氨基酸含量的變化，進(jìn)一步確定美拉德反應(yīng)底物類(lèi)型。

2.2 最優(yōu)炒籽條件下亞麻籽脫脂粉中還原糖及游離氨基酸含量變化

亞麻籽中含有的還原糖和氨基酸在炒籽過(guò)程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，對(duì)比炒籽(180℃，20 min)前后亞麻籽脫脂粉中還原糖和游離氨基酸含量的變化，以此推測(cè)亞麻籽在炒籽過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)的潛在底物。最優(yōu)炒籽條件下亞麻籽脫脂粉中還原糖及游離氨基酸含量變化分別見(jiàn)表3、表4。

表3 最優(yōu)炒籽條件下亞麻籽脫脂粉中還原糖含量變化 mg/g

表4 最優(yōu)炒籽條件下亞麻籽脫脂粉中游離氨基酸含量變化

由表3可以看出，亞麻籽中含量較高的可溶性還原糖半乳糖、葡萄糖及果糖，經(jīng)炒籽后都有一定量的損失。炒籽前亞麻籽脫脂粉中半乳糖、葡萄糖含量分別為0.41、0.98 mg/g，炒籽后完全損失；炒籽前亞麻籽脫脂粉中果糖含量為0.56 mg/g，炒籽后損失66.07%；鼠李糖、阿拉伯糖及木糖含量低于檢出限，且炒籽前后沒(méi)有明顯變化。以上結(jié)果與魏長(zhǎng)慶等[16]報(bào)道的相似，炒籽過(guò)程葡萄糖、果糖及半乳糖的含量消耗較大。亞麻籽中可溶性還原糖下降的程度大小為葡萄糖>半乳糖>果糖，初步推斷葡萄糖、半乳糖及果糖是亞麻籽在炒籽過(guò)程中為美拉德反應(yīng)提供羰基的主要潛在底物。

由表4可知：未經(jīng)炒籽的亞麻籽脫脂粉中精氨酸含量最高，為0.63 mg/g，其次是丙氨酸、谷氨酸，含量分別為0.56、0.49 mg/g；經(jīng)炒籽后，精氨酸、丙氨酸及谷氨酸含量下降明顯，谷氨酸、亮氨酸損失率較大；與此同時(shí)賴(lài)氨酸作為含有兩個(gè)氨基的氨基酸(ε-NH2和α-NH2)，化學(xué)性質(zhì)活潑，相比其他氨基酸更易產(chǎn)生美拉德產(chǎn)物。魏長(zhǎng)慶[17]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖-亮氨酸、葡萄糖-蛋氨酸及葡萄糖-賴(lài)氨酸比葡萄糖-精氨酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物添加到亞麻籽油中的過(guò)氧化值低。綜上所述，根據(jù)表4游離氨基酸含量變化情況及氨基酸化學(xué)性質(zhì)，選用精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸及賴(lài)氨酸作為亞麻籽炒籽過(guò)程中為美拉德反應(yīng)提供氨基的主要潛在底物。

2.3 美拉德模擬反應(yīng)體系構(gòu)建及MRPs抗氧化活性探究

以葡萄糖、半乳糖、果糖和精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸為底物，在底物物質(zhì)的量比1∶1、反應(yīng)溫度120℃、反應(yīng)時(shí)間1 h條件下制備MRPs，以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，篩選抗氧化效果較好的底物組合，不同底物組合MRPs的DPPH自由基清除率IC50值見(jiàn)表5。

表5 不同底物組合MRPs的DPPH自由基清除率IC50值 mg/mL

由表5可看出，賴(lài)氨酸作為氨基酸底物與還原糖所制備的MRPs的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其次是精氨酸、谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸。這是由于賴(lài)氨酸和精氨酸含有多個(gè)氨基，且為堿性氨基酸，更易發(fā)生美拉德反應(yīng)[18]。除精氨酸外，在氨基酸相同的情況下，與不同還原糖配對(duì)制備MRPs，發(fā)現(xiàn)具有相似的DPPH自由基清除能力排序，即葡萄糖>半乳糖>果糖，結(jié)合還原糖的結(jié)構(gòu)差異可以看出，葡萄糖作為醛糖, 相比酮糖(如果糖)，末端基團(tuán)位阻效應(yīng)小，更易與氨基酸發(fā)生反應(yīng)[19]。與此同時(shí)，賴(lài)氨酸和精氨酸在與葡萄糖反應(yīng)過(guò)程中，色澤加深明顯，DPPH自由基清除能力比較強(qiáng)，因此推測(cè)亞麻籽炒籽過(guò)程中起到抗氧化作用的主要是精氨酸、賴(lài)氨酸和葡萄糖的反應(yīng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選用賴(lài)氨酸和精氨酸與葡萄糖為底物，對(duì)其美拉德模擬反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并探究相應(yīng)的抗氧化活性。

2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德模擬反應(yīng)進(jìn)程和MRPs抗氧化活性的影響

在美拉德反應(yīng)過(guò)程中，中間產(chǎn)物及類(lèi)黑精的最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值及pH可以表征美拉德反應(yīng)的進(jìn)程，DPPH自由基清除率則反映了MRPs的抗氧化活性。在底物物質(zhì)的量比(葡萄糖與氨基酸物質(zhì)的量比)1∶1、反應(yīng)時(shí)間1 h條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)美拉德模擬反應(yīng)進(jìn)程的影響，并將所得MRPs稀釋至0.5 mg/mL(下同)，測(cè)定其DPPH自由基清除率，研究反應(yīng)溫度對(duì)MRPs抗氧化能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)進(jìn)程及MRPs抗氧化活性的影響

由圖1可看出：兩個(gè)波長(zhǎng)下MRPs的吸光值總體上隨著反應(yīng)溫度的升高而增加；葡萄糖-賴(lài)氨酸和葡萄糖-精氨酸反應(yīng)體系，中間產(chǎn)物含量(A294)在180℃時(shí)最高，反應(yīng)溫度進(jìn)一步上升后，出現(xiàn)一定程度的下降，可能為中間產(chǎn)物分解或進(jìn)一步生成了類(lèi)黑精化合物；對(duì)于類(lèi)黑精含量(A420)，葡萄糖-賴(lài)氨酸MRPs的A420隨著反應(yīng)溫度的升高持續(xù)上升，于200℃達(dá)到最高，而葡萄糖-精氨酸MRPs的A420在180℃時(shí)達(dá)到最高后，出現(xiàn)了一定程度的下降。美拉德反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)和氨基的消耗會(huì)導(dǎo)致pH下降[20-21]，180℃的反應(yīng)溫度下，兩個(gè)反應(yīng)體系MRPs的pH最小。隨著反應(yīng)溫度的升高，在120～180℃范圍內(nèi)，葡萄糖-賴(lài)氨酸MRPs的DPPH自由基清除率從34.51%上升至41.88%，葡萄糖-精氨酸MRPs的DPPH自由基清除率從32.16%上升至39.89%，180℃和200℃下MRPs的DPPH自由基清除能力沒(méi)有明顯差異。綜上所述，升高反應(yīng)溫度可以推進(jìn)美拉德反應(yīng)進(jìn)程，并有利于生成抗氧化物質(zhì)、加深反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度，但反應(yīng)溫度過(guò)高對(duì)MRPs抗氧化能力的增長(zhǎng)貢獻(xiàn)不大，兩個(gè)反應(yīng)體系在180℃反應(yīng)綜合效果最好。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德模擬反應(yīng)進(jìn)程和MRPs抗氧化活性的影響

在底物物質(zhì)的量比(葡萄糖與氨基酸物質(zhì)的量比)1∶1、反應(yīng)溫度180℃條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德模擬反應(yīng)進(jìn)程和MRPs抗氧化活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)進(jìn)程及MRPs抗氧化活性的影響

由圖2可看出，反應(yīng)前期葡萄糖-賴(lài)氨酸和葡萄糖-精氨酸體系MRPs的含量隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)明顯上升，105 min時(shí)達(dá)到最大，之后降低。45～105 min范圍內(nèi)兩個(gè)體系美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物含量差別不大，120 min時(shí)葡萄糖-賴(lài)氨酸美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物含量略低于葡萄糖-精氨酸的，而葡萄糖-賴(lài)氨酸美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物含量在45～120 min范圍內(nèi)均略高于葡萄糖-精氨酸的。葡萄糖-賴(lài)氨酸MRPs的pH在前期隨反應(yīng)時(shí)間變化明顯，105 min時(shí)pH為6.50；葡萄糖-精氨酸MRPs的pH隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且105 min后降低幅度不大。45～105 min范圍內(nèi)，兩個(gè)體系MRPs的DPPH自由基清除率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，葡萄糖-賴(lài)氨酸MRPs的DPPH自由基清除率從40.84%上升至49.29%，葡萄糖-精氨酸MRPs的DPPH自由基清除率從38.15%上升至47.35%，可見(jiàn)在確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度條件后，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可以進(jìn)一步提高M(jìn)RPs的DPPH自由基清除能力。在反應(yīng)后期(105～120 min)，中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物類(lèi)黑精含量降低，DPPH自由基清除率和pH的變化趨于平穩(wěn)。因此，確定反應(yīng)時(shí)間為105 min。

2.3.4 底物物質(zhì)的量比對(duì)美拉德模擬反應(yīng)進(jìn)程和MRPs抗氧化活性的影響

在反應(yīng)溫度180℃、反應(yīng)時(shí)間105 min條件下，考察底物(葡萄糖與氨基酸)物質(zhì)的量比對(duì)美拉德模擬反應(yīng)進(jìn)程和MRPs抗氧化活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 底物物質(zhì)的量比對(duì)美拉德反應(yīng)進(jìn)程及MRPs抗氧化活性的影響

從圖3可以看出：在底物物質(zhì)的量比3∶1的條件下，葡萄糖-賴(lài)氨酸MRPs含量達(dá)到最大值，A294和A420分別為0.169 4和1.537 5；而在底物物質(zhì)的量比1∶1條件下，葡萄糖-精氨酸MRPs含量最大，A294和A420分別為0.115 7和1.087 7。pH的變化反映體系內(nèi)氨基酸的反應(yīng)程度，兩個(gè)體系MRPs的pH最低點(diǎn)也分別出現(xiàn)在底物物質(zhì)的量比3∶1 (葡萄糖-賴(lài)氨酸)和1∶1(葡萄糖-精氨酸)。葡萄糖-賴(lài)氨酸MRPs的DPPH自由基清除率在底物物質(zhì)的量比3∶1時(shí)最高，為63.71%，而葡萄糖-精氨酸MRPs的DPPH自由基清除率在底物物質(zhì)的量比1∶1時(shí)最高(47.35%)，趨勢(shì)與A294和A420相同。 綜上所述，當(dāng)葡萄糖與賴(lài)氨酸物質(zhì)的量比為3∶1，葡萄糖與精氨酸物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力比較好。基于此，利用葡萄糖和賴(lài)氨酸、精氨酸制備MRPs的最優(yōu)條件分別為反應(yīng)溫度180℃、反應(yīng)時(shí)間105 min、底物物質(zhì)的量比3∶1和反應(yīng)溫度180℃、反應(yīng)時(shí)間105 min、底物物質(zhì)的量比1∶1。

2.4 MRPs對(duì)冷榨亞麻籽油氧化穩(wěn)定性的影響

為了探究MRPs對(duì)冷榨亞麻籽油氧化穩(wěn)定性的影響，添加200 mg/kg按最優(yōu)條件制備的MRPs到冷榨亞麻籽油中，在60℃下進(jìn)行Schaal烘箱法加速氧化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定過(guò)氧化值和p-茴香胺值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 MRPs對(duì)冷榨亞麻籽油氧化穩(wěn)定性的影響

由圖4可知：隨著加速氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，空白冷榨亞麻籽油的過(guò)氧化值從2.94 mmol/kg上升至20.79 mmol/kg，與易志[22]報(bào)道的冷榨亞麻籽油60℃恒溫箱下儲(chǔ)存過(guò)氧化值變化趨勢(shì)相近；添加了200 mg/kg MRPs(葡萄糖-精氨酸)的冷榨亞麻籽油，過(guò)氧化值從2.94 mmol/kg上升至18.11 mmol/kg；添加了200 mg/kg MRPs(葡萄糖-賴(lài)氨酸)的冷榨亞麻籽油，過(guò)氧化值從2.94 mmol/kg上升至16.62 mmol/kg。在60℃儲(chǔ)藏14 d后，與空白冷榨亞麻籽油相比,添加200 mg/kg MRPs分別使過(guò)氧化值降低了12.89%(葡萄糖-精氨酸)和20.06%(葡萄糖-賴(lài)氨酸)，對(duì)過(guò)氧化值抑制效果不明顯。空白冷榨亞麻籽油的p-茴香胺值從3.67上升至28.63；添加了200 mg/kg MRPs(葡萄糖-精氨酸)的冷榨亞麻籽油，p-茴香胺值從3.67上升至19.85，相較于空白冷榨亞麻籽油降低了30.67%；添加了200 mg/kg MRPs(葡萄糖-賴(lài)氨酸)的冷榨亞麻籽油p-茴香胺值最低，p-茴香胺值從3.67上升至17.98，相較于空白冷榨亞麻籽油下降了37.20%。本研究中添加MRPs(葡萄糖-賴(lài)氨酸、葡萄糖-精氨酸)對(duì)p-茴香胺值的抑制效果與Mohanan等[23]在亞麻籽油中添加200 mg/kg抗壞血酸棕櫚酸酯并進(jìn)行60℃加速氧化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相當(dāng)。

3 結(jié) 論

一定程度的炒籽對(duì)亞麻籽油的氧化穩(wěn)定性有積極影響，在180℃、20 min炒籽條件下，亞麻籽油烘箱法加速氧化20 d后的全氧化值及醛類(lèi)物質(zhì)含量最低。炒籽過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)的潛在底物為葡萄糖、半乳糖、果糖和精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸；葡萄糖-賴(lài)氨酸及葡萄糖-精氨酸MRPs的抗氧化活性較好。對(duì)于葡萄糖-賴(lài)氨酸反應(yīng)體系，在反應(yīng)溫度180℃、反應(yīng)時(shí)間105 min、底物物質(zhì)的量比3∶1條件下反應(yīng)，MRPs抗氧化能力最好；對(duì)于葡萄糖-精氨酸反應(yīng)體系，在反應(yīng)溫度180℃、反應(yīng)時(shí)間105 min、底物物質(zhì)的量比1∶1條件下反應(yīng)，MRPs抗氧化能力最好。兩種體系制備的MRPs對(duì)冷榨亞麻籽油過(guò)氧化值增長(zhǎng)的抑制效果有限，但對(duì)p-茴香胺值的增長(zhǎng)有一定的抑制作用。由此可知，炒籽中賴(lài)氨酸、精氨酸與葡萄糖的美拉德反應(yīng)是提高熱榨亞麻籽油氧化穩(wěn)定性的原因之一，其MRPs對(duì)冷榨亞麻籽油的氧化有一定的抑制作用。