米糠油體的酶法提取工藝優化

呂雯雯，高倩茹，郝 佳，閆秋麗，許朵霞

(1.北京工商大學 食品與健康學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風味化學重點實驗室，食品質量與安全北京實驗室,北京 100048； 2.北京市經濟管理學校,北京 100048)

隨著人們對綠色、安全食品的追求，使用天然食品原料已成為未來食品產業的發展趨勢。米糠是稻米加工過程中的主要副產品，含有稻米中2/3的營養成分和9/10的人體必需元素，有“天然營養寶庫”的稱號[1]。米糠中含有15%的蛋白質、16%～22%的脂肪、10%的水分，還含有生育酚、谷維素、角鯊烯等活性物質，具有增強免疫力、治療肥胖癥、預防心血管疾病甚至抗癌的作用[2-4]。我國米糠產量豐富，但存在深加工不足的問題，造成了米糠資源的浪費。

植物油體是天然的微納米級原料，富含多不飽和脂肪酸、磷脂、生育酚和植物甾醇等生物活性物質，作為天然復合物乳狀液，可廣泛應用于飲料、乳制品、巧克力和冰淇淋等食品中[5-7]。此外，植物油體為天然乳化劑，作為載體具有良好的輸送和釋放能力，有利于食品的低能耗生產[8-10]。從米糠中提取米糠油體作為天然乳化劑應用于食品工業中，具有廣泛的應用前景，可解決米糠深加工不足的問題。

目前，植物油體的提取方法主要有水法和酶法[11-12]。水法提取效率通常較低；而酶法提取可以解決此問題，如Kapchie等[13]利用酶法提取大豆油體，選用復合果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶，在60℃、150 r/min條件下處理大豆粉20 h，大豆油體的提取率顯著高于水法提取的。目前國內外對于米糠油體的研究不多，且主要是對傳統水法提取的米糠油體成分和物理性質的研究。

米糠中含有較多的半纖維素，其中木聚糖含量最高。木聚糖酶可以分解米糠細胞壁及米糠中的木聚糖[14-15]。植物提取酶中包括纖維素酶、半纖維素酶、β-葡聚糖酶和果膠酶，可以顯著破壞植物細胞壁[16]。因此，本文擬采用木聚糖酶及植物提取酶針對性地提取米糠油體，以油體得率、粒徑分布、穩定性及微觀結構為指標，探究復合酶配比、復合酶添加量、pH及酶解時間對米糠油體提取的影響，優化酶法提取米糠油體的工藝條件，為米糠油體的開發與應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

米糠，哈爾濱北大荒米業有限公司。植物提取酶(主要包含纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶，純度≥99%)，寧夏和氏璧生物有限公司；木聚糖酶(純度≥99%)、尼羅藍(純度≥98%)、尼羅紅(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；疊氮化鈉，分析純，美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；Allegra X-15R超高速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；S3500粒度儀，美國Microtrac公司；Lumisizer穩定性分析儀，德國L.U.M.GmbH公司；Eutech 700 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FV3000激光共聚焦顯微鏡，美國Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠油體的制備

將過450 μm(40目)篩的米糠以料液比1∶6(質量比)加入到1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，調節pH，加入復合酶攪拌混勻，50℃下酶解一定時間后，4 500 r/min、23℃離心20 min，取上層，即為米糠油體，在米糠油體中加入0.01%的疊氮化鈉防止微生物生長。按下式計算米糠油體得率(x)。

x=m1/m2×100%

(1)

式中：m1為米糠油體質量，g；m2為米糠質量，g。

1.2.2 米糠油體粒徑分布的測定

采用S3500粒度儀測定米糠油體的粒徑分布。取一定量樣品，用1 mmol/L磷酸緩沖液稀釋400倍，以水為介質，連續相和分散相的折射率分別設為1.33和1.45，濕法測量。

1.2.3 米糠油體穩定性分析

使用Lumisizer穩定性分析儀測定米糠油體的穩定性。取0.4 mL樣品，在轉速4 000 r/min、測試溫度25℃、掃描間隔60 s/次、掃描次數255次條件下，測定樣品的移動速率。

1.2.4 米糠油體微觀結構分析

采用FV3000激光共聚焦顯微鏡分析米糠油體微觀結構。在米糠油體中加入油體質量的0.02%尼羅紅對油相進行染色，取少量染色樣品置于載玻片上，用60倍目鏡進行觀察，調節激發波長為488 nm和635 nm。

1.2.5 米糠油體中脂肪和蛋白質含量的測定

采用索氏抽提法測定米糠油體脂肪含量；采用BCA法測定米糠油體蛋白質含量。

1.2.6 數據分析

數據采用Excel 2017及SPSS 17.0軟件進行統計分析，用OriginPro 8.5.1進行繪圖，實驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 復合酶配比對米糠油體得率和性質的影響

在復合酶添加量為2%、pH為5.0、酶解溫度為50℃、酶解時間為1.5 h條件下，調整復合酶配比(木聚糖酶與植物提取酶質量比，下同)分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，從米糠油體得率、粒徑分布、穩定性與微觀結構方面研究復合酶配比對米糠油體制備的影響。

2.1.1 得率

復合酶配比對米糠油體得率的影響見圖1。從圖1可以看出，隨著木聚糖酶所占比例的增大，米糠油體得率呈現先增大后減小的趨勢，復合酶配比為2∶1時，米糠油體得率最大，為73.6%。可能是因為米糠中含有較多的木聚糖，當木聚糖酶占比增加時，米糠中的木聚糖被充分酶解，米糠油體釋放增加；但當木聚糖酶占比再增加，則植物提取酶占比過少，無法充分破壞細胞壁，導致米糠油體釋放減少，得率降低。

圖1 復合酶配比對米糠油體得率的影響

2.1.2 粒徑分布及穩定性

復合酶配比對米糠油體粒徑分布的影響見圖2。

圖2 復合酶配比對米糠油體粒徑分布的影響

由圖2可看出，當復合酶配比為1∶3和1∶2時，米糠油體粒徑呈雙峰分布，且粒徑較大，可能是由于油體液滴聚結所致。隨著木聚糖酶所占比例的增大，油體粒徑呈單峰分布，表現出均一性。復合酶配比為2∶1時，液滴粒徑最小，為8.37 μm，在該條件下提取的米糠油體液滴均勻性最佳。

復合酶配比對米糠油體穩定性的影響見圖3。移動速率值越小，樣品體系越穩定[17]。由圖3可看出，隨木聚糖酶所占比例的增大，米糠油體穩定性逐漸增大，復合酶配比為2∶1時，米糠油體穩定性最高。此后，木聚糖酶占比再增大，米糠油體穩定性不再發生改變。因此，復合酶配比為2∶1時，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩定性最好。

圖3 復合酶配比對米糠油體穩定性的影響

2.1.3 微觀結構

復合酶配比對米糠油體微觀結構的影響見圖4。由圖4可看出，復合酶配比為1∶3和1∶2時，米糠油體凝結明顯，大小分布不均勻，多形成大油滴。復合酶配比為1∶1和2∶1時，米糠油體聚集體粒徑變小，油體呈現出相對穩定的狀態。復合酶配比為3∶1時，米糠油體粒徑變大，由之前的聚結狀態變為絮凝狀態，導致油體失穩。

圖4 復合酶配比對米糠油體微觀結構的影響

綜上，米糠油體提取的最佳復合酶配比為2∶1。

2.2 復合酶添加量對米糠油體得率和性質的影響

在復合酶配比為2∶1、pH為5.0、酶解溫度為50℃、酶解時間為1.5 h條件下，調整復合酶添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%(以體系質量計)，從米糠油體得率、粒徑分布、穩定性與微觀結構方面研究復合酶添加量對米糠油體制備的影響。

2.2.1 得率

復合酶添加量對米糠油體得率的影響見圖5。從圖5可以看出，隨著復合酶添加量從1%增加到5%，米糠油體得率呈現先增加后降低的趨勢，復合酶添加量為3%時，米糠油體得率最大，為79.5%。酶添加量增大，使得酶與底物的接觸面積增大，從而使米糠細胞壁被充分破壞，釋放出更多的油體[18]；但酶的過度添加會導致油體完整性被破壞，降低米糠油體得率。

圖5 復合酶添加量對米糠油體得率的影響

2.2.2 粒徑分布及穩定性

復合酶添加量對米糠油體粒徑分布的影響見圖6。

圖6 復合酶添加量對米糠油體粒徑分布的影響

從圖6可以看出，復合酶添加量為1%～3%時，米糠油體粒徑較小且均一，呈單峰分布，這可能是由于復合酶將細胞壁上部分多糖水解為單糖，適量的單糖可能在油體的油水界面上與蛋白質相互作用產生強烈的空間作用力，有效阻礙了油體間的聚結[19]。同時，隨著復合酶添加量的增加，米糠油體的粒徑分布峰值向更小的尺寸移動，復合酶添加量為3%時，粒徑最小。但是，復合酶添加量超過3%時，米糠油體粒徑呈現雙峰分布，粒徑大小不均一。

復合酶添加量對米糠油體穩定性的影響見圖7。從圖7可以看出，隨著復合酶添加量的增加，米糠油體穩定性呈現先增加后降低的趨勢。復合酶添加量為3%時，米糠油體穩定性最好，可能是由于該條件下米糠油體具有較小的粒徑及較好的分散性。因此，復合酶添加量為3%時，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩定性最好。

圖7 復合酶添加量對米糠油體穩定性的影響

2.2.3 微觀結構

復合酶添加量對米糠油體微觀結構的影響見圖8。從圖8可以看出，復合酶添加量為1%時，米糠油體表現出明顯的聚結，多形成大油滴，在宏觀上表現為不穩定的狀態，這可能是細胞壁沒有被充分水解，體系中單糖含量少，不足以與界面膜上的蛋白質形成共聚物，導致油體液滴之間空間作用力弱，從而使液滴間發生聚結。當復合酶添加量增加至2%～3%時，油體分布均勻，粒徑大小集中，宏觀體系表現為穩定狀態，主要是因為體系中單糖含量增加，可以與界面膜上的蛋白質充分作用，形成共聚物，使油體表面界面膜變厚，從而提高米糠油體穩定性[20]。當復合酶添加量再增大時，米糠油體液滴出現絮凝現象，且形成較多不規則的大油滴，這可能是由于體系中單糖含量過多，出現損耗絮凝，導致米糠油體失穩。

圖8 復合酶添加量對米糠油體微觀結構的影響

綜上，米糠油體提取的最佳復合酶添加量為3%。

2.3 pH對米糠油體得率和性質的影響

在復合酶配比為2∶1、復合酶添加量為2%、酶解溫度為50℃、酶解時間為1.5 h條件下，調節pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，從米糠油體得率、粒徑分布、穩定性與微觀結構方面研究pH對米糠油體制備的影響。

2.3.1 得率

pH對米糠油體得率的影響見圖9。pH對于酶活性有顯著性影響，未處于最適pH時，酶活性較低。由于本研究中兩種細胞壁多糖酶的最適pH不同，因此將其復配后，需要重新驗證最適pH。從圖9可以看出，隨著pH的增大，米糠油體得率呈現先增大后降低的趨勢，pH為5.5時，米糠油體得率最高，為75.6%。

圖9 pH對米糠油體得率的影響

2.3.2 粒徑分布及穩定性

pH對米糠油體粒徑分布的影響見圖10。

圖10 pH對米糠油體粒徑分布的影響

從圖10可以看出，在pH 4.0和pH 4.5條件下，米糠油體的粒徑呈雙峰分布，粒徑分布不均，發生油體聚結，可能是由于米糠油體表面蛋白質等電點在pH 4.0左右，使得蛋白質沉淀，米糠油體失穩。pH在5.0～6.0時，米糠油體粒徑呈單峰分布，粒徑分布均勻，主要集中在8 μm左右。

pH對米糠油體穩定性的影響見圖11。從圖11可以看出，pH 在4.0～6.0范圍內，米糠油體的穩定性呈現先增高后降低的趨勢，pH為5.0時，米糠油體的穩定性最佳。因此，pH為5.0時，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩定性最好。

圖11 pH對米糠油體穩定性的影響

2.3.3 微觀結構

pH對米糠油體微觀結構的影響見圖12。從圖12可以看出，pH為4.0時，米糠油體聚結形成較多的大油滴，穩定性差，與粒徑分布的結果一致。pH增大到5.0時，米糠油體大小分布集中，分散均勻，呈現出穩定的狀態。pH在5.5～6.0范圍內，米糠油體發生絮凝，逐漸失穩，主要是因為米糠油體空間相互作用力減弱。

圖12 pH對米糠油體微觀結構的影響

綜上，米糠油體提取的最佳pH為5.0。

2.4 酶解時間對米糠油體得率和性質的影響

在復合酶配比為2∶1、復合酶添加量為2%、pH為5.0、酶解溫度為50℃條件下，分別攪拌反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，從米糠油體得率、粒徑分布、穩定性與微觀結構方面研究酶解時間對米糠油體制備的影響。

2.4.1 得率

酶解時間對米糠油體得率的影響見圖13。從圖13可以看出，隨著酶解時間的延長，米糠油體得率呈現先增加后降低的趨勢，酶解時間為1.5 h時，米糠油體得率最高。

圖13 酶解時間對米糠油體得率的影響

2.4.2 粒徑分布及穩定性

酶解時間對米糠油體粒徑分布的影響見圖14。從圖14可以看出，酶解時間在0.5～2.0 h時，米糠油體粒徑呈單峰分布，酶解時間為1.5 h時，米糠油體粒徑分布最集中，酶解時間延長至2.5 h時，米糠油體粒徑呈雙峰分布，出現大的聚集體，可能是由于酶解時間的延長，油體的界面膜被破壞，油滴聚合導致。

圖14 酶解時間對米糠油體粒徑分布的影響

酶解時間對米糠油體穩定性的影響見圖15。從圖15可以看出，隨著酶解時間的延長，米糠油體穩定性呈現先增大后降低的趨勢。酶解0.5～1.0 h時，米糠油體穩定性差，可能是由于酶解時間過短，酶解不充分，僅少量油體被釋放出來，游離的少量油體空間作用力弱。酶解1.5 h時，米糠油體顯示出較好的穩定性，可能是由于該條件下米糠酶解充分，大量油體被釋放出來，油體間的空間作用力較強[21]。但隨著酶解時間的繼續延長，體系中的油滴發生聚結，體系失穩，從而導致穩定性變差。因此，酶解時間為1.5 h時，米糠油體粒徑分布最均一，粒徑最小且穩定性最好。

圖15 酶解時間對米糠油體穩定性的影響

2.4.3 微觀結構

酶解時間對米糠油體微觀結構的影響見圖16。從圖16可以看出，酶解時間為0.5 h時，米糠油體粒徑分布不均，有強烈的絮凝及聚結作用，表現為不穩定狀態。當酶解時間延長至1.5 h時，米糠油體粒徑逐漸變小，分布均勻，無明顯的絮凝和聚結，穩定性良好。繼續延長酶解時間，米糠油體又表現出不穩定狀態，可能是酶解過度導致油體完整性被破壞。這與粒徑及穩定性的結果一致。

圖16 酶解時間對米糠油體微觀結構的影響

綜上，米糠油體提取的最佳酶解時間為1.5 h。

2.5 米糠油體基本組成

在酶法提取米糠油體的最佳工藝條件(復合酶配比為2∶1，復合酶添加量為3%，pH為5.0，酶解時間為1.5 h，酶解溫度為50℃)下提取米糠油體，檢測米糠油體的基本組成，可得干基條件下米糠油體中脂肪含量為(87.37±0.16)%，蛋白質含量為(12.63±0.14)%。

3 結 論

選用木聚糖酶和植物提取酶，以油體得率、粒徑分布、穩定性及微觀結構為考察指標，對酶法提取米糠油體的條件(復合酶配比、復合酶添加量、pH、酶解時間)進行了優化。結果顯示，在木聚糖酶與植物提取酶質量比2∶1、復合酶添加量3%、pH 5.0、酶解溫度50℃和酶解時間1.5 h條件下提取米糠油體，所得米糠油體得率高，粒徑分布集中，粒徑達到微米級，且酶法提取不會破壞米糠油體表面蛋白質，得到的米糠油體穩定性良好、結構完整。本研究為米糠油體的開發與應用提供一定的理論基礎，對于提高油體穩定性和拓寬油體在食品領域的應用有重要意義。