SUMO化修飾在精子發(fā)生過(guò)程中的作用

欒家妍，李 朋，韓邦旻

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科臨床醫(yī)學(xué)中心，上海 200080

精子發(fā)生是一個(gè)連續(xù)而復(fù)雜的過(guò)程，其從原始生殖細(xì)胞分化為精原干細(xì)胞開(kāi)始，經(jīng)歷精原細(xì)胞自我更新、增殖和分化，精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子變形，最終形成精子。其中，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都可能導(dǎo)致精子發(fā)生異常，表現(xiàn)為少弱畸精子癥，嚴(yán)重時(shí)則會(huì)導(dǎo)致無(wú)精子癥。精子發(fā)生異?？捎蛇z傳因素和表觀遺傳因素引起，前者包括染色體異常、Y 染色體微缺失、致病基因突變等，后者包括非編碼RNA 對(duì)染色質(zhì)的重塑［1-4］、DNA 甲基化修飾、組蛋白翻譯后修飾［5］等。SUMO 化修飾（SUMOylation）作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，通過(guò)在一系列特定酶的作用下，使底物蛋白與小分子泛素相關(guān)修飾物 蛋 白 （small ubiquitin-related modifier protein，SUMO）相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。由于底物蛋白不盡相同，SUMO 化修飾也發(fā)揮了不同作用。在精子發(fā)生過(guò)程中，SUMO 在精母細(xì)胞、延長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成熟精子中均有表達(dá)且表達(dá)水平各異，提示SUMO 化修飾可能參與了精子發(fā)生中的多個(gè)重要事件?；诖?，本文針對(duì)SUMO 化修飾在精子發(fā)生的不同階段中的作用進(jìn)行介紹。

1 SUMO化修飾

SUMO化修飾是底物蛋白的賴氨酸殘基與SUMO形成異肽鍵的過(guò)程［6］，能夠調(diào)控一系列生物學(xué)事件，包括DNA 損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答、腫瘤免疫、細(xì)胞周期和凋亡等。在細(xì)胞中，SUMO 化修飾過(guò)程是可逆的，由SUMO 家族、SUMO 修飾酶系、SENP 家族共同參與完成。SUMO化修飾需經(jīng)歷成熟、激活、結(jié)合和連接4 個(gè)步驟（圖1）。最初，SUMO 是無(wú)活性的SUMO 前體，經(jīng)SUMO 特異性蛋白酶（sentrin/SUMO-specific protease，SENP）切割后，與SUMO E1 激活酶連接從而被激活；隨后，在E2 結(jié)合酶的作用下，其可通過(guò)異肽鍵連接到目標(biāo)蛋白賴氨酸殘基上，形成底物、E2 結(jié)合酶、SUMO 的三者復(fù)合物；最后，E3 連接酶與該復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)復(fù)合物中E2結(jié)合酶的解離，從而使SUMO 與底物連接得更為直接且緊密。同時(shí)， SENP 家族成員可切斷底物與SUMO的異肽鍵，完成去SUMO化。

圖1 SUMO化修飾與去SUMO化修飾的基本過(guò)程Fig 1 Basic process of SUMOylation and deSUMOylation

2 SUMO家族在精子發(fā)生中的作用

1996 年SUMO 被首次發(fā)現(xiàn)，且相關(guān)報(bào)道［7］顯示其三維結(jié)構(gòu)與泛素相似，僅在氨基酸序列和表面結(jié)構(gòu)分布上存在差異。在哺乳動(dòng)物中，參與SUMO 化修飾的SUMO 家族主要包括4 個(gè)成員，即SUMO1、SUMO2、SUMO3 和SUMO4；其 中，SUMO2 和SUMO3 具有高度同源性（約97%），常被統(tǒng)稱為SUMO2/3；而SUMO4 僅表達(dá)于腎臟、肝臟和淋巴結(jié)中［8］。

2.1 SUMO1在精子發(fā)生中的作用

SUMO1 主要作用于精母細(xì)胞的第一次減數(shù)分裂過(guò)程，影響染色體聯(lián)會(huì)［9］。在第一次減數(shù)分裂前期，SUMO1 表達(dá)始于偶線期，隨后在粗線期表達(dá)增多，直至雙線期停止。同時(shí)，SUMO1 定位于粗線期的染色質(zhì)軸上；在粗線期的早期，主要呈線性模式表達(dá)，與聯(lián)會(huì)復(fù)合體共定位于所有染色體上；而在粗線期的后期，可孤立表達(dá)于9 號(hào)、1 號(hào)染色體著絲粒區(qū)域的異染色質(zhì)上［10］。9 號(hào)染色體著絲粒區(qū)域是最后發(fā)生聯(lián)會(huì)的區(qū)域，如聯(lián)會(huì)出現(xiàn)異常則將導(dǎo)致精子發(fā)生過(guò)程停滯［11］，且多數(shù)不育男性的9 號(hào)、1 號(hào)染色體均存在異常［12］，因此推測(cè)SUMO1 在9 號(hào)染色體的表達(dá)可能會(huì)影響精子發(fā)育過(guò)程。此外，在不育癥患者的樣本中發(fā)現(xiàn)，即使異染色質(zhì)聯(lián)會(huì)不連續(xù)甚至受阻，SUMO 化修飾依然存在，精母細(xì)胞仍可發(fā)育至粗線期［13］，因此SUMO （特別是SUMO1） 可能是一個(gè)保護(hù)性蛋白。同時(shí)，有研究［14］在雙鏈DNA 斷裂位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了SUMO1 的表達(dá)，進(jìn)一步證明SUMO1 在染色體重組中發(fā)揮了一定的作用。另有研究［15-16］發(fā)現(xiàn)，SUMO 可能與泛素共同影響精母細(xì)胞的第一次減數(shù)分裂，并參與調(diào)節(jié)染色體軸的組裝和聯(lián)會(huì)；由于泛素可促使蛋白發(fā)生降解，繼而提示在此階段SUMO 化修飾可能發(fā)揮了保證精母細(xì)胞發(fā)育的作用。

在精子變形過(guò)程中，SUMO1可影響線粒體功能。在延長(zhǎng)形精子細(xì)胞中，SUMO1 主要定位于精子的頭部、頸部和中段［17］，特別是中段的線粒體之中。考慮到外膜線粒體錨定蛋白連接酶作為SUMO E3連接酶，可通過(guò)SUMO 化修飾的動(dòng)力相關(guān)蛋白1促進(jìn)線粒體分裂［18］，而在無(wú)精子、弱精子受試者參與的研究［19］中證實(shí)，精子表達(dá)的SUMO1越多，精子運(yùn)動(dòng)能力越差，繼而推測(cè)SUMO1 可能通過(guò)裂解線粒體而影響精子活力，但還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

此外，Sertoli 細(xì)胞也可受到SUMO1 的影響。在Sertoli 細(xì)胞的細(xì)胞核中，雄激素受體（androgen receptor，AR）經(jīng)SUMO 化修飾后，其轉(zhuǎn)錄活性受到抑制；而在體外抑制了SUMO 化修飾作用后，小鼠和人類的Sertoli 細(xì)胞均會(huì)發(fā)生凋亡［20］。這提示SUMO1和AR均可影響Sertoli細(xì)胞，特別是Sertoli細(xì)胞中的雄激素依賴性轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。在梗阻性無(wú)精子癥患者中，Sertoli細(xì)胞核仁內(nèi)的SUMO1表達(dá)缺乏、AR表達(dá)大量存在；而在生精阻滯的非梗阻性無(wú)精子癥患者中，二者的表達(dá)均極低［21］；由此可以推斷，SUMO1和AR 的表達(dá)異?？赡苤苯佑绊慡ertoli 細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致男性不育，但具體機(jī)制尚不明確。

2.2 SUMO2/3在精子發(fā)生中的作用

在精子發(fā)生過(guò)程中SUMO2/3 先于SUMO1 表達(dá)，即在細(xì)線期和偶線期均可檢測(cè)到［22］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，SUMO2/3主要集中表達(dá)于9號(hào)染色體著絲粒處，少量呈灶性或彌散分布于其余常染色體著絲粒處。且在Sumo1敲除小鼠中，其睪丸生精功能正常［8］。因此，我們推測(cè)SUMO2/3 可能代償SUMO1 的功能或獨(dú)立發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

YANG等［23］發(fā)現(xiàn)，非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞COS7內(nèi)含有豐富的、未結(jié)合的SUMO2/3，當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激后，SUMO化修飾的蛋白質(zhì)將明顯增加，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。SHRIVASTAVA 等［24］發(fā)現(xiàn)，吸煙產(chǎn)生的氧化反應(yīng)可損傷精子細(xì)胞，而此時(shí)精子細(xì)胞中SUMO2/3的表達(dá)也會(huì)增加。且當(dāng)精子細(xì)胞發(fā)生形態(tài)或功能的異常時(shí)，SUMO常在精子頸部過(guò)度表達(dá)［25］。因此，SUMO2/3 的表達(dá)或與精子細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)，這可能是導(dǎo)致不育的潛在因素之一。

3 SUMO 化修飾酶系在精子發(fā)生中的作用

3.1 SUMO E1激活酶在精子發(fā)生中的作用

SUMO E1 激活酶 是由SAE1 和UBA2 共2 個(gè)亞基組成的異二聚體，其活性位點(diǎn)位于亞基UBA2上，可與SUMO 結(jié)合。SUMO 前體被SENP 切割后，與UBA2 上的活性位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，從而激活SUMO。在細(xì)胞的SUMO 化修飾過(guò)程中，SUMO E1 激活酶發(fā)揮作用是第一步，而該步驟一旦被抑制，SUMO將無(wú)法被活化，繼而使得SUMO1 和SUMO2/3 無(wú)法與底物連接，導(dǎo)致SUMO 化修飾無(wú)法進(jìn)行。目前，有關(guān)SUMO E1激活酶在精子發(fā)生中的相關(guān)研究較少。

3.2 SUMO E2結(jié)合酶在精子發(fā)生中的作用

Ubc9 是目前發(fā)現(xiàn)的、唯一的SUMO E2 結(jié)合酶［26］。在 精 子 發(fā) 生 中，Ubc9 的 定 位 與SUMO1、SUMO2/3 相似，主要表達(dá)于粗線期和雙線期的聯(lián)會(huì)復(fù)合體和XY 小體內(nèi)［27-28］。在Ubc9敲除小鼠的囊胚細(xì)胞中染色質(zhì)高度濃縮，染色體在后期分離時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤，導(dǎo)致非整倍體產(chǎn)生從而影響細(xì)胞的有絲分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；同時(shí)，Ubc9 的缺失還會(huì)阻礙囊胚內(nèi)細(xì)胞SUMO 化修飾的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和物質(zhì)運(yùn)輸能力受損，進(jìn)而影響胚胎存活［29］。

3.3 SUMO E3連接酶的作用

研究［7］顯示，SUMO E3 連接酶可提高SUMO E2 結(jié)合酶促進(jìn)SUMO 與底物分子相結(jié)合的能力，以及SUMO 化修飾的效率。近年來(lái)，SUMO E3 連接酶在精子發(fā)生中的作用備受關(guān)注。

在哺乳動(dòng)物中，活化STAT 的蛋白抑制劑（protein inhibitor of activated STAT，PIAS）是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為廣泛的SUMO E3 連接酶家族成員。PIAS 家族由至少5 個(gè)成員組成，分別是PIAS1、PIAS3、PIASy 和PIASx，其中PIASx 又分為PIASxα和PIASxβ共2個(gè)亞類［30-32］。

（1）碼頭拆除分區(qū)清挖順序：4區(qū)不受地基處理影響，開(kāi)工后先施工4區(qū)，5區(qū)在地基滿足強(qiáng)度要求后立即進(jìn)行開(kāi)挖。施工順序?yàn)?區(qū)→其他→5區(qū)，由下游往上游施工。

在新生大鼠睪丸中，PIASx 和PIAS1 的表達(dá)較低，僅見(jiàn)于少量的精原細(xì)胞內(nèi)；隨著大鼠睪丸的發(fā)育，PIASx 主要表達(dá)于精母細(xì)胞中，而PIAS1 表達(dá)晚于PIASx，主要在晚期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中，之后二者表達(dá)量逐漸遞增［33-34］；當(dāng)大鼠睪丸發(fā)育成熟后，二者僅局限表達(dá)于Sertoli 細(xì)胞和精母細(xì)胞中。有研究［35］發(fā)現(xiàn)，Piasx被敲除后小鼠能夠存活且仍具有一定的生育能力，但睪丸重量明顯減少，精子細(xì)胞凋亡異常增加。此外，PIASx 和PIAS1 還可介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物1 （signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 的SUMO 化 修飾［36］，調(diào)節(jié)Sertoli 細(xì)胞中的AR 的轉(zhuǎn)錄活性；同時(shí)，PIAS1 也被證實(shí)為男性前列腺癌的影響因素之一［37］，這可能也與其對(duì)AR 的影響有關(guān)。在精子發(fā)生過(guò)程中，PIAS1 和PIASx 可通過(guò)多種方式發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為調(diào)控精母細(xì)胞減數(shù)分裂和AR的功能。

SUMO 化修飾的RET 指蛋白（RET finger protein，RFP）高表達(dá)于人類的多種腫瘤細(xì)胞系和雄性生殖細(xì)胞中，并與精子發(fā)生有關(guān)［38-39］。且有研究［40］證實(shí)，RFP、PIASy和SUMO1定位于小鼠睪丸的精母細(xì)胞的XY 小體中。由于在粗線期性染色體形成XY 小體可抑制X 和Y 染色體編碼的基因表達(dá)，因此推測(cè)SUMO 化修飾可能增強(qiáng)RFP 的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而有助于基因沉默，促進(jìn)XY小體的形成。

4 SENP家族在精子發(fā)生中的作用

SENP 家族可通過(guò)切割SUMO 和底物之間的異肽鍵使底物去SUMO化修飾，以維持目標(biāo)蛋白的SUMO化和去SUMO化的動(dòng)態(tài)平衡。在哺乳動(dòng)物中，目前已知的SENP家族成員有SENP 1～3、SENP 5～7，可分為3 個(gè)亞家族；其中，亞家族1 包括SENP1 和SENP2，可解離SUMO1 和SUMO2/3；亞家族2 包括SENP3 和SENP5，可解離SUMO2/3 與底物的共價(jià)結(jié)合［41］；亞家族3 包括SENP6 和SENP7，可分解SUMO2/3 聚合鏈［42］。此外，SENP 家族（主要是SENP1 和SENP2）還可切割SUMO 前體，從而在SUMO E1 激活酶的作用下使SUMO發(fā)生活化［43］。SENP家族對(duì)SUMO化修飾的調(diào)節(jié)還會(huì)影響細(xì)胞的功能，研究［44］發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾可抑制基因的表達(dá)，而SENP 家族的去SUMO化修飾能夠再次激活被抑制的基因。

目前，相關(guān)研究對(duì)SENP 家族在精子發(fā)生過(guò)程中的定位及作用底物已有了初步認(rèn)識(shí)。SENP1、SENP2和SENP6 的表達(dá)模式與SUMO2/3、SAE1/UBA2 和Ubc9 相同，即在精母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期的細(xì)線期、偶線期、粗線期表達(dá)持續(xù)增加，而在圓形精子細(xì)胞中表達(dá)較低。SENP5 在該細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期的細(xì)線期、偶線期的表達(dá)低于粗線期，但粗線期前后其表達(dá)量沒(méi)有變化，這和SUMO1 的表達(dá)模式相類似［45］。SENP3 和SENP7 在該細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期的細(xì)線期和偶線期表達(dá)最為豐富，之后隨著精子細(xì)胞的成熟而表達(dá)下降［27］，這與PIAS1、PIASx 和PIASy 的表達(dá)模式相反［45］。上述這些表達(dá)差異再次提示，SUMO 化修飾在精子發(fā)生過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化，雖然其詳細(xì)的作用機(jī)制尚不明確，但可以推測(cè)SENP1、SENP 2 從精子發(fā)生早期即開(kāi)始表達(dá)，解離SUMO1 和SUMO2/3，以促進(jìn)二者各自發(fā)揮作用；在發(fā)育過(guò)程中，SENP5 解離SUMO2/3 與底物，使SUMO2/3 恢復(fù)未結(jié)合狀態(tài)以應(yīng)對(duì)細(xì)胞應(yīng)激，同時(shí)避免過(guò)量SUMO2/3 損傷精子細(xì)胞，或促進(jìn)SUMO2/3 參與染色體聯(lián)會(huì)；在精子形成后期，SENP3、SENP7的表達(dá)較少，與SUMO2/3 此時(shí)表達(dá)穩(wěn)定相符。此外，SENP3 的作用也不局限于去SUMO 化修飾。研究［46］發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠的Sertoli細(xì)胞中，SENP3可通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3 的轉(zhuǎn)錄活性，影響血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）的基因表達(dá)；且在Senp3敲除小鼠的睪丸內(nèi)肌動(dòng)蛋白會(huì)發(fā)生解聚［47］，而肌動(dòng)蛋白是BTB的超微結(jié)構(gòu)。因此，SENP3 的缺失會(huì)影響B(tài)TB 的緊密連接，從而影響B(tài)TB對(duì)精子細(xì)胞的保護(hù)作用。

5 總結(jié)與展望

SUMO化修飾參與了精子發(fā)生過(guò)程中的多個(gè)重要事件。首先，SUMO化修飾可作用于精母細(xì)胞的第一次減數(shù)分裂，SUMO1、SUMO2/3 和Ubc9 參與染色體聯(lián)會(huì)，且PIASx、PIAS1 的表達(dá)有助于調(diào)控該減數(shù)分裂過(guò)程。其次，SUMO 化修飾可影響生精微環(huán)境，SUMO1、PIASx 和PIAS1 均 參 與 調(diào) 節(jié)Sertoli 細(xì) 胞 和AR 之間的關(guān)系，SENP3 有利于保證BTB 的緊密連接。同時(shí)，SUMO化修飾的過(guò)度或缺失均會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生過(guò)程的異常，但具體的分子機(jī)制尚未被明確，亟待進(jìn)一步的相關(guān)研究加以證實(shí)。

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

韓邦旻負(fù)責(zé)文章設(shè)計(jì)及論文修改；欒家妍、李朋負(fù)責(zé)論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and the manuscript was revised by HAN Bangmin. The manuscript was drafted and revised by LUAN Jiayan and LI Peng. All authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-11

·Accepted：2022-07-01

·Published online：2022-07-28