Sirt1對小鼠肝再生影響的研究

魏 韜 周晶琳 徐紹娜 劉 洋 陸 迪 祝慧慧

（牡丹江醫學院基礎醫學院，黑龍江 牡丹江，157011）

小鼠部分肝切除是一種簡單、有效且安全的肝損傷模型，術后肝功能的恢復主要取決于殘余肝臟的迅速再生能力。因此，研究肝再生的分子機制具有重要的臨床意義。

組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1是Sirtuins家族成員之一，在哺乳動物細胞中普遍表達，主要定位于細胞核和細胞質中。Sirt1通過對靶蛋白去乙酰化作用參與機體的多種生物過程，如基因轉錄、氧化應激、能量代謝、細胞衰老和免疫炎性反應等。研究表明，Sirt1在肝癌組織和細胞系中高表達，提示其在肝癌的發生、發展過程中可能發揮著重要的生物學作用。通過Sirt1對大鼠肝毒性藥物化學損傷肝臟的細胞保護及細胞毒性的調節作用的研究，表明Sirt1很可能是作為參與肝保護的因子。然而，Sirt1在肝再生過程中的作用還不清楚，亟需深入研究探討。因此，本研究以小鼠為研究對象，對Sirt1在肝再生中的作用進行初步調查研究，以期為臨床肝再生治療提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 儀器和藥品

①實驗儀器：LD4-2A型低速離心機（生產企業：北京醫用離心機廠） ，世安通風柜（生產企業：北京世安科興科技開發有限公司），FA1104型電子天平（生產企業：上海良平儀器儀表有限公司） ，101-2AB型電熱鼓風干燥箱（生產企業：天津市泰斯特儀器有限公司） ，微量紫外分光光度計（生產企業：美國Thermo Fisher有限公司），EcoTMReal-Time PCR儀（生產企業：Illumina有限公司），高壓滅菌鍋（生產企業：上海博訊有限公司），肝素鈉抗凝管（生產企業：石家莊康衛仕醫療器械有限公司），生物安全柜（生產企業：蘇州安泰空氣技術有限公司）、狗兔二用解剖臺（生產企業：上海康為醫療科技發展有限公司），手術燈、鼠籠、小鼠固定用泡沫磚、大頭針、固定線、注射器、針頭、手術刀、手術剪、手術鑷、眼科剪、蚊式止血鉗、眼科鑷、培養皿、縫針、非吸收性外科縫線、無菌紗布、無菌棉球、一次性使用滅菌橡膠外科手套。0.9%氯化鈉溶液、 醫用乙醇、碘伏、烏拉坦。

②實驗藥品：TRIzol plus RNA purification Kit，PrimeScript Reverse Transcriptase和SYBR Green Supermix（生產企業：大連寶生物有限公司），谷丙轉氨酶試劑盒（生產企業：南京建成生物工程有限公司）。

1.2 實驗動物及分組

本實驗中使用的小鼠均來自于牡丹江醫學院實驗動物中心。飼養在SPF級環境中，溫度控制在（22.0±2.0）℃，飼喂普通飼料，自由進食和進水。在具體實驗過程中，將15只健康狀態良好且體質量為20～25 g的BALB/c小鼠（8周齡）隨機分為肝切除組12只，對照組3只。對照組BALB/c小鼠處理方式為打開腹腔后隨即縫合；而實驗組在進行70%肝切除術后需要繼續喂養，并在術后12 h、24 h、48 h和72 h時分別隨機取3只小鼠處死，其中對照組在假手術后立即處死。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠的捉拿、麻醉和固定方法

麻醉藥物選用20%烏拉坦，采用0.5 mL/100 mg劑量注射。首先使用手術鑷夾住小鼠尾部將其從鼠籠中取出，用右手提起小鼠尾后部，轉至其眩暈后，將其置于電子秤上的燒杯內稱體質量，準確讀取數值。麻醉時需用右手提起小鼠尾部將其置于鼠籠蓋表面上，此時確保小鼠后肢懸空，僅允許其前肢著地，用左手拇指和食指緊緊抓住小鼠雙耳及其頭頸部的被毛。讓小鼠仰臥位固定于左手中，本實驗可采用腹腔注射，穿刺部位選擇在其左下腹處，麻醉時將注射器針頭與其腹中線成45°，針頭刺入角度應與腹部皮膚呈 20°，刺入后緩慢注入藥物。將麻醉好的小鼠仰臥位固定于狗兔二用解剖臺泡沫磚上，四肢用固定繩分別系于泡沫磚側面的4只大頭釘上。頭部用固定繩系住小鼠門齒固定于泡沫磚一端大頭釘上。

1.3.2 小鼠肝切除手術操作方法

所有手術器械手術前需要進行高壓滅菌。手術過程中，可先用手術剪逐一剪去小鼠腹部中線處被毛，充分暴露其腹部皮膚，隨后采用醫用乙醇對其進行消毒。兩人操作時，一人雙手持止血鉗夾持腹部正中線兩側的皮膚并盡量向上提起，以防止傷及臟器，另一人用手術剪自劍突下剪開被毛3 cm，然后同樣用手術剪自劍突下剪開腹部皮膚和肌肉組織3 cm，使用蚊式止血鉗牽拉腹腔切兩側，暴露小鼠腹腔后便可清晰見到肝臟。視野下小鼠肝臟可分為四個解剖功能單位，包括中葉、左外葉、右葉和尾葉。分別結扎并切除肝臟左外葉和中葉，建立70%肝切除小鼠模型。術后迅速縫合腹部切口，并注射抗生素，待小鼠蘇醒后確保其能正常進食、進水，確保小鼠能夠繼續存活。

1.3.3 小鼠肝臟體質量比測定方法

實驗過程中所有小鼠需要在不同時間點稱量體質量，即在術前和術后12 h、24 h、48 h和72 h時稱量體質量，并在處死后取肝臟稱量質量，計算不同時間點肝臟體質量比[肝臟相對質量 =肝臟質量（g）/體質量（g）×100%]，隨后將肝臟保存于液氮中，以備后續RT-qPCR實驗使用。

1.3.4 血清中谷丙轉氨酶活性測定方法

從小鼠眼球取血，使用肝素鈉抗凝管收集1 mL小鼠血液，隨后立即在4 ℃條件下離心10 min，分離出血清。每只小鼠血清分離出后應立即測定谷丙轉氨酶ALT含量，血清中谷丙轉氨酶ALT含量按照試劑盒操作說明書進行測定。

1.3.5 RT-qPCR法檢測肝組織中Sirt1 mRNA水平

取出對照組和實驗組術后48 h的肝組織，放入DEPC水預處理的研缽中，加入液氮快速研磨。采用TRIzol法提取肝組織中的總RNA，利用微量紫外分光光度計（生產企業：美國Thermo Fisher公司）檢測所得的總RNA濃度和純度。使用Takara反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA后，通過EcoTMReal-Time PCR儀進行RT-qPCR反應，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，實驗中所用的引物序列如下。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組小鼠肝再生過程中肝臟體質量比變化

肝臟具有很強的再生能力，本實驗結果表明，在對實驗組小鼠實施70%肝切除術后的12～72 h時間范圍內，小鼠肝臟體質量比隨著時間的延長而逐漸增加，同時也說明在肝再生作用下，小鼠受損傷的肝臟會逐漸得到修復，與手術前比較，損傷肝臟的重量也會相應逐漸增加。見表1。

2.2 兩組小鼠血清中谷丙轉氨酶水平變化

大部分谷丙轉氨酶存在于肝細胞的胞質中，當肝臟受到損傷時，胞質中的谷丙轉氨酶釋放入血，導致血清中谷丙轉氨酶活性升高。與此相一致，本實驗結果表明在小鼠肝臟造成損傷后的12～24 h，血清中谷丙轉氨酶活性隨著時間的延長而逐漸升高；而隨著時間繼續延長，在損傷后24～72 h，血清中谷丙轉氨酶活性隨著時間的延長而呈逐漸下降趨勢。這些結果表明，小鼠肝損傷會導致血清中谷丙轉氨酶活性升高，而在肝再生作用下，小鼠損傷的肝臟會逐漸得到修復，從而促使血清中谷丙轉氨酶活性逐漸下降，直至恢復到接近肝臟受損前的水平。見表2。

2.3 兩組小鼠肝組織中Sirt1的mRNA水平變化

通過RT-qPCR實驗發現，與對照組相比，實驗組行70%肝切除術后48 h，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1的mRNA水平較低；本實驗結果表明，肝切除會導致組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1轉錄水平降低，該變化可能與肝再生過程密切相關。見圖1。

3 討論

肝臟是重要的代謝器官和解毒器官，當乙醇或有毒物質攝入、自身免疫刺激、病毒性肝炎等多種因素引起肝臟損傷時，處于靜止期的肝細胞進入細胞周期并進行增殖，表現出強大的再生和修復能力，但是酗酒或慢性病毒性肝炎引起大量肝細胞壞死時，肝臟的再生能力便不足以維持自身功能，導致肝功能衰竭。

組蛋白乙酰化是由組蛋白乙酰基轉移酶和組蛋白去乙酰基轉移酶共同調控的動態平衡。乙酰化能增強賴氨酸上的正電荷，增加組蛋白與DNA之間的排斥力，激活基因轉錄；相反，去乙酰化能清除乙酰基團，使染色質結構由疏松轉為致密狀態，從而導致基因沉默。研究表明，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1參與組蛋白H4K16去乙酰化修飾過程。也有報道證實，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1也能夠參與非組蛋白HMGB1、P53等的去乙酰化修飾過程。綜上所述，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1能夠參與多種生物學過程，并且發揮了重要的生物學作用。在肝臟中，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1能夠調控并編碼代謝途徑所涉的相關酶。肝臟中組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1的缺失顯著影響了細胞G1/S期的進展，這可能與脂肪酸-β氧化缺陷引起的脂質積累有關。研究證實，Sirt1在小鼠肝再生過程中具有調節肝細胞增殖、晝夜節律和脂質代謝的重要作用。近期研究表明，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1參與到肝癌的發生、發展過程中。當前更多的熱點集中到組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1與肝癌及肝再生過程的相關性研究。70%肝切除會對小鼠肝臟造成損傷，在術后12 h、24 h、48 h，實驗組ALT活性均高于對照組，與對照組比較，術后12 h實驗組ALT活性約是對照組的4.5倍，術后24 h實驗組ALT活性是對照組的6.5倍，術后48 h實驗組ALT活性是對照組的3.6倍；與對照組比較，術后72 h，ALT活性基本恢復到損傷前的水平。本研究發現，小鼠70%肝切除術后48 h，Sirt1的mRNA水平降低，因此推測Sirt1的去乙酰化酶活性可能參與了小鼠肝再生過程，為闡明肝損傷后的肝再生過程提供了新的思路。為應對各種類型的損傷，肝臟會迅速地做出反應，通過再生以恢復其原來的大小和功能。部分肝切除術后的肝再生是研究肝細胞增殖最有效的模型之一，涉及復雜的信號事件以及復雜的相互作用，許多問題仍需闡明。在切除嚙齒動物2/3的肝臟后，殘留的肝細胞會迅速進入細胞周期，并進行大約兩個周期的細胞分裂。許多因素，包括激素、細胞因子、生長因子及其耦合信號轉導途徑，有助于啟動和促進肝細胞通過G1/S期的進展，進入到隨后的細胞分裂。該過程所涉及的相關基因以不同的時間方式被激活，從而維持了再生過程的效率。此外，特定的代謝變化也與肝臟再生過程有關。特別是在肝再生過程中發生了短暫的脂肪變性，這似乎對適當的再生反應很重要，但是其功能尚不明確。Sirt1在哺乳動物正常肝功能的控制中起著核心作用，并參與調節包括糖異生、脂肪酸-β氧化和膽固醇等的代謝過程。Sirt1在肝臟中的表達和活性調節導致了肝臟晝夜節律基因表達和代謝的改變，這表明其在維持肝臟代謝和表觀遺傳調控過程中具有極其重要的作用。然而，組蛋白去乙酰基轉移酶Sirt1是如何參與到小鼠肝再生過程中，如何發揮作用，需要進一步展開深入的研究和探討，以期為今后的臨床研究工作提供更加詳實的基礎數據。