靜置培養條件下混合菌群對活性黑5脫色效果分析

汪 波，劉 娜，秦祎婷，朱少東，郭慶賢，張 悅，董傳斌，張海洋

(1 宿州學院環境與測繪工程學院，安徽 宿州 234000；2 宿州學院沱河流域面源污染控制與生態修復技術研究中心，安徽 宿州 234000)

隨著科技水平發展與社會進步，人們對服裝染色技術的要求日益提高，偶氮染料在紡織工業中有著廣泛的應用。然而，伴隨產生的工業染料廢水污染性極強，導致水體環境的污染和惡化，危害人體的健康[1-3]。偶氮染料脫色降解方法主要有物理法、化學法、生物法等[4-5]，其中，利用生物處理技術，既能降低染料廢水處理費用，又能減少化學藥劑的使用，從而可以降低一定程度上的環境污染。謝學輝等[6]利用主要由克雷伯氏菌(Klebsiella)和變形菌(Proteus)組成的混合菌群FF，對偶氮染料活性黑5(200 mg/L)進行脫色降解，結果表明，混合菌群對活性黑5的脫色率在反應24 h后可達到91.4%。李雨等[7]篩選出一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，對多種偶氮染料(剛果紅、甲基橙、甲基紅等)具有較好的脫色效果。本研究在靜置培養條件下，從宿州市埇橋區生活污水處理廠污泥中馴化混合菌群，并在不同pH值、初始染料濃度、碳源條件下，分析混合菌群對活性黑5的脫色效果差異性，為偶氮染料活性黑5的生物脫色提供新的菌群。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 染料和培養基

本實驗所選偶氮染料是相對分子質量991.82的活性黑5，其分子式為C26H21N5Na4O19S6，特征峰波長是597 nm。

培養基組成(g/L)：磷酸二氫鉀2.66、氯化銨0.20、無水硫酸鈉0.50、牛肉膏1.50、蛋白胨1.50，活性黑5(按需要定量)。

活性黑5、磷酸二氫鉀、氯化銨、無水硫酸鈉、牛肉膏、蛋白胨、果糖、淀粉、麥芽糖、蔗糖、木糖均為分析純以上級別。

1.1.2 實驗設備與儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、紫外可見分光光度計、電子天平、pH計、超凈工作臺、生化培養箱、干燥箱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合菌群的馴化

對宿州市埇橋區生活污水處理廠污泥進行采樣，并將其用作初始接種污泥，以偶氮染料活性黑5為脫色目標物。首先，將10 mL的活性污泥接入一個裝有90 mL染料溶液的錐形瓶中，控制染料初始濃度為10 mg/L。然后每隔48 h以10%的體積百分比將細菌重新接入到新鮮的培養基中，當脫色率達到80%時，適當增加染料的濃度，進行下一階段的馴化。通過2個月左右的馴化和篩選，獲得了活性黑5的脫色混合菌群。利用光學顯微鏡對混合菌群進行鏡檢，分析其形態特征。

1.2.2 不同pH值對脫色效果的影響

分別調節染料培養基的pH為5、6、7、8、9，以10%(V/V)的接種量，分別取10 mL培養了48 h的混合菌群，加入含有90 mL新鮮培養基的錐形瓶中，加入活性黑5使其最終濃度為100 mg/L。靜置培養72 h，每隔24 h取脫色菌液，并以10000 r/min離心，再取上清液。采用紫外-可見分光光度計測定特征波長597 nm的吸光度值，并按下式計算脫色率。

脫色率=(A0-At)/A0×100%

式中：A0——反應0 h脫色液在597 nm的吸光度值

At——反應t h脫色液在597 nm的吸光度值

1.2.3 不同初始染料濃度對脫色效果的影響

在上述最佳pH值條件下，控制培養基中染料的最終濃度分別為50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、150 mg/L，探討不同初始染料濃度對混合菌群脫色活性黑5效果的差異性，具體實驗步驟同1.2.2。

1.2.4 不同碳源對脫色效果的影響

分別采用不同的碳源替換原有培養基中的牛肉膏，使培養基的碳氮源分別為果糖+蛋白胨、淀粉+蛋白胨、麥芽糖+蛋白胨、蔗糖+蛋白胨、木糖+蛋白胨，探討不同碳源對混合菌群脫色活性黑5的效果差異性，具體實驗步驟同1.2.2。

2 結果與討論

2.1 混合菌群形態特征分析

利用光學顯微鏡對馴化得到的混合菌群進行鏡檢，結果如圖1所示。顯微鏡下的細菌大小不一、形態各異，以桿菌為主，這些形態不同的細菌組成細菌群落，通過彼此之間的相互協作，往往能夠獲得較好的脫色效果[8]。惠豐立等[9]利用由Clostridium、Pseudomonas和Shewanella組成的混合菌群AR1，對活性紅BF-3BN(200 mg/L)進行脫色研究，結果表明該菌群在最佳環境條件下可獲得95%以上的脫色率，脫色效果顯著。

圖1 顯微鏡下混合菌群形態Fig.1 Morphology of mixed flora under microscope

2.2 pH值對脫色效果的影響

染料廢水微生物處理過程中，環境pH值會對微生物的生長造成一定的影響，從而影響細菌對染料的去除[10]。結果表明，不同pH對混合菌群脫色率的影響見圖2所示。可以看出，當pH為5時，菌群對活性黑5的脫色率在72 h為73.48%；當pH為6、7、8時，脫色率在72 h分別為74.09%、76.64%、和79.72%；隨著pH進一步升高到9，菌群對活性黑5的脫色率可達到81.89%。結果表明，菌群不同pH環境下，菌群的生長代謝受到不同影響，與偏酸性、中性條件相比，在偏堿性條件下，混合菌群獲得更高的脫色率，說明菌群的耐堿性較強，偏堿性環境也更適宜微生物生長代謝。與本研究結果類似，周思懿等[11]也在研究中指出，菌群在偏堿性條件下獲得了更高的脫色率。由于一般實際染料廢水的pH偏高，因此，本研究獲得的混合菌群對于處理實際染料廢水具有現實指導意義。

圖2 不同pH值條件下混合菌群對活性黑5的脫色率Fig.2 Decolorization rate of Reactive Black 5 by mixed flora under different pH valueconditions

2.3 不同初始染料濃度對脫色效果的影響

在上述最佳pH條件下，研究不同初始染料濃度對脫色活性黑5的影響，結果見圖3所示。從圖3中可以看出，在初始染料濃度為50～150 mg/L時，混合菌群對活性黑5的脫色率在72 h均可達到80%左右，呈現出較好的脫色效果。當初始染料濃度為50 mg/L時，混合菌群對活性黑5的脫色率在72 h時為82.78%，隨著初始染料濃度不斷增高，混合菌群對偶氮染料的脫色率逐漸降低。這是因為隨著染料濃度的增加，其毒性也隨之增大，微生物的正常生長和代謝活動會在一定程度上受到抑制，從而導致脫色效果變差[12]。

圖3 不同初始染料濃度條件下混合菌群對活性黑5的脫色率Fig.3 Decolorization rate of Reactive Black 5 by mixed flora under different initial dye concentration conditions

2.4 不同碳源對脫色效果的影響

混合菌群脫色染料的效果與微生物的生長密不可分，而微生物的生長和繁殖離不開碳源，因此，外來碳源的添加能夠促進細菌脫色效果[13-14]。本研究中，在pH為9條件下，分別采用不同碳源替換原培養基中的牛肉膏，不同碳源對菌群脫色效果的影響見圖4所示。由圖4可以看出，當果糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、木糖分別與蛋白胨組合后，混合菌群對活性黑5的脫色率在72 h均達到90%左右，呈現出較為顯著的脫色效果，且均優于牛肉膏、蛋白胨組合(圖3)。其中，除淀粉外，其他碳源存在下，反應24 h的脫色率均達到85%以上，說明混合菌群對活性黑5脫色速率較快。Ceretta等[15]也在研究中指出，葡萄糖、淀粉的添加能夠提高混合菌群對染料廢水的脫色效果。

圖4 不同碳源條件下混合菌群對活性黑5的脫色率Fig.4 Decolorization rate of Reactive Black 5by mixed flora under different carbon source conditions

3 結 論

本研究以宿州市埇橋區生活污水處理廠污泥作為原始接種污泥，馴化獲得能夠脫色偶氮染料活性黑5的混合菌群，并研究不同pH值、初始染料濃度、碳源等因素對混合菌群脫色效果的影響。研究結果表明，隨著pH的升高，混合菌群脫色活性黑5效果逐漸增強，說明偏堿性條件更有利于混合菌群的生長繁殖和脫色作用。當初始染料濃度升高(50～150 mg/L)時，混合菌群的脫色作用逐漸減弱，說明高濃度染料對混合菌群的生長和繁殖具有一定抑制作用。當pH為9時，不同碳源與蛋白胨組合后，均取得了較為顯著的脫色效果。本研究為后續進一步研究混合菌群群落結構及其實際應用奠定基礎。