HPLC法測定不同產區枸杞子中4種活性成分含量*

尹美娟，王 靚

(河北中醫學院，河北 石家莊 050091)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，始載于《神農本草經》。《本草綱目》上記載：“枸杞能補肝腎、潤肺、生精、益氣。此乃平補之藥”。現代藥理學研究表明，枸杞具有促進和調節抗衰老、免疫功能和保肝三大藥理作用[1]。枸杞作為一味藥食兩用的藥材，在人們的生活中扮演了一個重要的角色[2]，產地較為豐富，市場上流通多為道地產區寧夏的枸杞子，除寧夏外也被廣泛種植于青海、甘肅、河北等中國北方省份。目前，如何簡單、快速的判斷不同性產區枸杞的藥用價值，是藥學研究工作者的一項重要的課題。

枸杞中主要含有多糖、黃酮、酚酸和生物堿等類化學成分。其中酚酸類成分具有清除自由基抗氧化、增強免疫力、抗菌消炎、抗腫瘤等藥理作用[3-4]。因此,酚酸類成分是枸杞生物活性的重要物質基礎。枸杞具有這些藥理活性可能與其中的某些酚類成分存在一定關系。綠原酸是枸杞中主要酚酸類成分之一，研究表明綠原酸類具有提高免疫力、抗癌、抗菌等生理活性[5-7]。枸杞中以多糖和黃酮類化合物含量較高[8]，黃酮提取物對超氧陰離子、·OH、DPPH、亞硝基以及ABTS自由基具有顯著的清除能力[9],蘆丁是枸杞中主要的黃酮苷類化合物之一，也屬于多酚類物質，具有明顯的抗氧化作用。研究發現，黑果枸杞葉中的黃酮類化合物具有顯著的抗衰老、降低血脂作用，可能與所含的蘆丁等黃酮類成分的含量有關[10]。咖啡酸屬于本丙酸類化合物，具有抗菌抗病毒、凝血、降血脂、中樞興奮等作用[11]。東莨菪內酯鼠香豆素類化合物，是枸杞中重要的生物活性成分之一[12]，具有抗炎、抗腫瘤、調節心血管等作用[13-14]。并且，東莨菪內酯等香豆素類成分在植物適應環境中具有非常重要的生態功能[15]。

本文通過對市面上常見的寧夏、青海、甘肅、河北4個產地枸杞子，建立HPLC高效液相色譜法同時對綠原酸、蘆丁、咖啡酸、東莨菪內酯4種有效成分含量進行測定分析，為后續的科學研究進行鋪墊。

1 儀器與材料

1.1 試驗設備器材

島津高效液相色譜儀(配置泵LC-20A型，DGU-20A5R真空脫氣機，LC-20AT溶液傳輸單元，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二級管陣列檢測器和色譜工作站)，日本島津公司；Bp211-D型電子天平(十萬分之一)，德國Sartorous公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；CHA-S恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；DHG-9145AZ型電熱干燥箱，上海恒科儀器有限公司；5810R型高速離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗材料

寧夏枸杞和甘肅枸杞樣品,安國市華仁藥材有限公司;青海枸杞和河北巨鹿枸杞樣品,安國市永泰中藥材有限公司;蘆丁,山東豐泰生物科技有限公司;綠原酸,三原天域生物制品有限公司;咖啡酸和東莨菪內酯,中國食品藥品檢定研究院;分析純甲醇,北京天地首和科技發展有限公司;乙腈,南昌市恒利化工有限公司;冰醋酸,上海暉創化學儀器有限公司;超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為DiamonsiL C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱，流動相A為乙腈-水-醋酸(5:94.5:0.5)，流動相B為乙腈-水-醋酸(72:27.5:0.5)，梯度洗脫(0～20 min，100%～90%A；20～35 min，90%～75%A；35～45 min，75%～50%A；45～55 min，50%～30%A；55～65 min，30%～0%A；65～70 min，0%～100%；70～75 min，100%～100%A)；流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為346 nm，對照品及樣品色譜圖見圖1所示。

圖1 混合對照品(A)與甘肅枸杞樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and Gansu Fructus lycii sample (B)

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸1.52 mg，咖啡酸0.68 mg，東莨菪內酯1.28 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成相應的貯備液。精密稱取蘆丁4.41 mg，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成相應的貯備液。然后，精密吸取各貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，既得混合對照品溶液(每1 mL溶液中分別含有綠原酸0.0152 mg，咖啡酸0.0068 mg，東莨菪內酯0.0128 mg，蘆丁0.0176 mg)。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的寧夏枸杞、青海枸杞、甘肅枸杞和河北枸杞10.000 g，用50%甲醇超聲提取15 min，料液比為(1:20)。提取完成后，提取液過濾，并用少量的甲醇多次洗滌濾渣，合并濾液濃縮提取液，并定容于10 mL量瓶中備用。使用時，從10 mL的量瓶中精密吸取濃縮的提取液1 mL于10 mL的量瓶中，并用50%的甲醇定容，用0.45 μm的有機濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關系考察

分別吸取“2.2”項下的混合對照品溶液，依照“2.1”項下的方法分別取5、10、15、20、25、30、40、45 μL注入色譜儀，以進樣量(μL)為自變量(X)，色譜峰面積為因變量(Y)，繪制標準曲線，建立回歸方程。線性考察結果見表1所示。

表1 各化學成分線性關系Table 1 Linear relationship of chemical components

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，依照“2.1”項下的方法進行實驗，連續重復進樣測定5次，計算峰面積RSD。結果綠原酸、咖啡酸、東莨菪內酯、蘆丁的RSD分別為0.2463%、0.2268%、1.7916%、0.1582%，表明儀器精密度良好。

2.6 重現性試驗

精密稱取同一枸杞樣品(寧夏)，按“2.3”項下的方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定。計算綠原酸、東莨菪內酯、咖啡酸和蘆丁的平均含量分別為0.0812 mg/g，0.1073 mg/g、0.0857 mg/g、0.2249 mg/g，RSD 分別為1.9%、1.2%、1.1%、1.9%。

2.7 穩定性試驗

精密吸取“2.3”項下的供試品溶液10 μL，依照“2.1”項下的方法，分別于0、2、4、8、12 h進樣，計算峰面積RSD。結果綠原酸、咖啡酸、東莨菪內酯、蘆丁的RSD分別為1.84%、0.49%、0.39%、1.07%，表明樣品在穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已測定含量的供試品(產地寧夏)9份，每份5 mL。然后，3份加入“2.2”項下的混合對照品溶液2 mL，3份加入混合對照品溶液3 mL，3份加入混合對照品溶液4 mL，在“2.1“項色譜條件下測定，計算加樣回收率RSD。結果見表2所示。

表2 加樣回收率結果Table 2 Add sample recovery results

2.9 含量測定

精密吸取“2.3”項下的各供試品溶液10 μL，依照“2.1”項下的方法進行實驗，計算峰面積，進而計算各產地供試品中6種成分的含量，結果見表3所示。

表3 不同產地枸杞子的含量測定結果(n=3)Table 3 Content determination of Fructus lycii from different origin(n=3) (mg/g)

3 結 論

枸杞既具有藥用價值又是養生滋補佳品，已有越多的人所喜愛，所以枸杞藥材質量備受關注。枸杞次生代謝產物種類較多，快速測定多種成分具有一定的難度，文獻研究發現，枸杞藥材質量的研究主要集中在多糖類、黃酮類、生物堿類、香豆素類等物質的含量測定[15-20]，想要一次性測定多種成分具有一定難度。為了能夠更簡單、快速、準確的反映枸杞的藥材質量，本研究選擇了4種枸杞中常見的不同類別的具有酚酸性的代表活性成分，建立了高效液相色譜含量測定方法，該方法簡單便捷，回收率高，精密度、線性、穩定性均符合要求，可作為枸杞藥材質量標準含量測定的方法。

由實驗測定結果分析可知:不同產地樣品中4種成分的含量大體上依次為寧夏樣品>青海樣品>甘肅樣品>河北樣品。寧夏枸杞作為道地藥材，4種活性成分含量均比較高，本方法也反映出寧夏枸杞的藥材質量最好，與其他文獻測定結果相符合，該方法具有準確性。所有樣品中4種成分的平均含量大體上依次為蘆丁>東莨菪內酯>咖啡酸>綠原酸。樣品中蘆丁和東莨菪內酯的含量較高，并且已經證實，蘆丁和東莨菪內酯都是枸杞子含有的具有體外抗氧化活性的重要化合物[21]，東莨菪內酯還在生長環境適應中具有重要作用，枸杞中東莨菪內酯含量較高，可能是其能適應生長環境較廣泛的原因。從以上結果可以看出，該方法能夠較為簡單的分辨枸杞藥材質量，但如果想要全面的評價寧夏枸杞的品質好壞，只是測定某些活性成分含量的差異是不全面的,還有需要通過指紋圖譜和藥效作用方面的研究,才能更充分的對枸杞的品質進行客觀、科學地評價。