基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的梔子柏皮湯化學成分分析*

景 涵,馮 芳,2

(1 中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2 藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009)

梔子柏皮湯始載于《傷寒論》，由梔子、黃柏、炙甘草三味藥材組成[1]。傳統中醫將梔子柏皮湯用于治療熱勝于濕的陽黃癥，現代臨床中常用于治療濕熱型黃疸、病毒性肝炎、特應性皮炎等[2-4]。目前針對梔子柏皮湯各組方藥材的化學成分及藥理作用已較為全面，但有關全方化學成分的研究仍為空白。本研究采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術，分別在正、負離子模式下采集數據，以對梔子柏皮湯中化學成分進行快速、全面的識別，為后續藥效物質基礎及質量控制研究奠定基礎。

1 實驗儀器和材料

1.1 儀 器

Vanquish Flex超高效液相色譜儀，美國Thermo公司；Q Exactive Orbitrap 高分辨質譜儀，美國Thermo公司；Xcalibur 4.1工作站，美國Thermo公司；AB135-S型電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司；RE-52CS旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；FD-1-SD型真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；KH-300DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；AnkeTGL-16B型臺式高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試劑和藥材

梔子，批號170727001，產地河北；黃柏，批號 200902，產地河北；炙甘草，批號201102，產地河北；均購自南京同仁堂藥店(江寧店)。將三味藥材分別粉碎，待用。

對照品鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、梔子苷、槲皮素、綠原酸購自成都曼斯特生物科技有限公司，甘草酸、甘草次酸、甘草苷、蘆丁購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，京尼平龍膽雙糖苷、京尼平、京尼平苷酸上海麥克林生化科技有限公司，純度均≥98%。甲醇和乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱XBridge BEH C18(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1.5 min，2% B；1.5～25 min，35% B；25～41 min，98% B；41～45 min，98%～2% B)。柱溫：40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量3 μL。

2.2 質譜條件

采用HESI離子源，正、負離子掃描模式；毛細管溫度350 ℃；噴霧電壓3.5 kV(正離子模式)/2.8 kV(負離子模式)；鞘氣和輔助氣為N2，鞘氣流速45 Arb，輔助氣流速10 Arb；掃描模式Full MS/dd-MS2: Full MS分辨率60000，采集范圍：m/z 100～1200 Da；dd-MS2分辨率15000，階梯碰撞能量：20、40、60 eV。

2.3 凍干粉制備

按照《傷寒論》記載，將原方藥量折合成現代劑量：稱取梔子30 g，黃柏18 g，炙甘草9 g，放入煎藥袋中，加10倍量水浸泡30 min后，武火煮沸，文火煎煮30 min，再分別以8倍、5倍量水同法煎煮，用6層紗布趁熱過濾，將3次煎煮濾液合并。用旋轉蒸發儀將濾液濃縮至膏狀，放入-20 ℃冰箱冷凍過夜后，于真空冷凍干燥機中凍干24 h，即得梔子柏皮湯凍干粉。同法制備梔子、黃柏、炙甘草單味藥材凍干粉，待用。

2.4 對照品溶液制備

稱取各對照品適量，加入甲醇溶解，配置成質量濃度為1 mg/mL的儲備液。精密吸取各儲備100 μL，于2 mL容量瓶中定容，配制成各成分質量濃度為50 μg/mL的混合對照品溶液，用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液備用。

2.5 供試品溶液制備

分別稱取適量梔子柏皮湯凍干粉和各單味藥材凍干粉，溶于去離子水中，配制成生藥濃度約為33.4 mg/mL的梔子柏皮湯水溶液，30.6 mg/mL的梔子水溶液，43.7 mg/mL的黃柏水溶液，21.0 mg/mL的炙甘草水溶液。分別加入一定量甲醇，使含醇量達70%，在4 ℃冰箱中靜置24 h后，以12000 rpm轉速離心10 min，取上清液，經0.22 μm濾膜濾過，取續濾液備用。

2.6 數據處理

首先，通過文獻檢索收集各藥材的成分信息，構建一個包含化學成分名稱、分子式、分子量、結構式，質譜裂解特征碎片的成分庫。然后，采用Xcalibur 4.1工作站對正、負離子模式下采集的質譜信息進行處理，設置質量誤差為10 ppm以內，根據一級質譜中的準分子離子的精確質量數計算得出化合物分子式；再根據二級質譜的碎片離子質量推測可能的裂解規律，并結合對照品信息、文獻報道的保留時間和特征碎片，或與Mass Bank、HMDB等數據庫提供的質譜信息比對，進行化合物確證。

3 結 果

梔子柏皮湯供試品按照2.1和2.2項所述條件采集的正、負離子模式下的總離子流圖如圖1所示。根據2.6項下數據處理方法，共鑒別出146個化學成分，具體信息見表1所示。

圖1 梔子柏皮湯在正離子(A)和負離子(B)模式下的 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of Zhi-Zi-Bo-Pi Decoction in positive(A) and negative(B) mode

表1 梔子柏皮湯的成分鑒定結果Table 1 Identification of the compounds in Zhi-Zi-Bo-Pi Decoction

續表1

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以化合物47為例，該化合物在正、負離子模式下的準分子離子峰分別為m/z 419.1331[M+H]+，m/z 417.1192[M-H]-，推測其分子式為C21H22O9。在二級質譜中，正離子模式下，丟失葡萄糖苷生成m/z 257.0807碎片離子，隨后通過RDA裂解產生黃酮類特征峰m/z 211.0751和m/z 137.0232；在負離子模式下，同樣丟失葡萄糖苷，生成255.0661特征碎片，經RDA反應后產生m/z 135.0088和m/z 119.0503，同時，后者丟失乙烯基，生成碎片離子m/z 91.0190。上述裂解特征與自建化合物庫中甘草苷裂解規律一致，再與對照品保留時間和裂解特征比對后，確定該化合物為甘草苷，負離子模式下可能的裂解規律見圖2所示。

圖2 甘草苷在負離子模式下可能的裂解途徑Fig.2 Proposed fragmentation pathway for Liquiritin in negative mode

4 結 論

本研究采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術對梔子柏皮湯化學成分進行了快速、全面分析，由于中藥復方成分復雜多樣，各成分質譜響應有較大差異，因此選擇在正、負離子兩種模式下進行分析。共鑒別出梔子柏皮湯中化學成分146個，其中環烯醚萜類24個，黃酮類28個，三萜類25個，生物堿類27個，有機酸類17個，單萜類9個，二萜類6個，其他各類化合物10個。本研究較為全面的闡明了梔子柏皮湯化學成分組成，為該方劑的進一步作用機制研究奠定了物質基礎。