新型齊墩果酸-1,2,3-三氮唑衍生物的設計、合成及活性研究*

楊東鑫，王友德，張麗穎

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北 承德 067000)

齊墩果酸(oleanolic acid, OA, 圖1)，又名慶四素或土當歸酸，屬齊墩果烷型五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)的化合物。女貞子為木樨科常綠喬木女貞(ligustrum lucidum ait)的干燥成熟果實。OA為女貞子植物中分離得到的有效成份，以游離體或糖苷的形式廣泛存在于在自然界中。隨著研究不斷進展，OA多樣的藥理作用已被揭曉，如抗腫瘤[1-3]、抗高血糖[4-5]、抗炎[6-7]、抗HIV[8]和抗氧化[9-10]等。OA的降糖作用也受到了廣泛關(guān)注：Ortiz-Andrade等通過口服葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)，OA可以抑制血漿葡萄糖濃度的增高[11]。然而，OA衍生物相關(guān)的降糖作用還未得到系統(tǒng)性研究。

圖1 OA衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route of OA derivatives

三唑類化合物因其具有顯著的廣譜生物活性，已成為研究的熱點藥效團[12-13]。其中，1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)因其在結(jié)合親和力方面表現(xiàn)十分顯著，且具有優(yōu)良的代謝穩(wěn)定性，在藥物開發(fā)中被廣泛應用[14]。因此，本文推測OA-1,2,3-三氮唑衍生物可能同樣具備降糖作用。實驗中以OA為先導化合物，應用click化學技術(shù)[15]和活性基團拼接原理，在OA的C-3位引入含不同取代基的1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)。本實驗對OA的C-3位進行結(jié)構(gòu)改造，合成了兩種新型OA-1,2,3-三氮唑衍生物，并對其進行了HepG2細胞葡萄糖消耗實驗，以期為女貞子降血糖方面的研究奠定基礎。

1 儀器與試劑

RY-1熔點儀,天津市分析儀器廠；電熱鼓風干燥箱,上海?，攲嶒炘O備有限公司；AVANCE-300 MHz型核磁共振儀,德國 布魯克公司；數(shù)顯示水浴鍋,國華電器有限公司；752分光光度計；maXis impact-HRMS,德國 布魯克公司；SHIMADZU FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀,德國布魯克公司。

葡萄糖測定試劑盒,上海榮升生物技術(shù)有限公司；FBS胎牛血清,鼎國生物技術(shù)有限公司；碳酸氫鈉,南京化學試劑有限公司；RMPI Medium 1640 GIBCO invitrogen corporation；二甲亞砜,上海凌峰化學試劑有限公司。所用試劑均為化學純或分析純試劑。人肝癌細胞HepG2，由承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科贈予。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物的合成與表征

2.1.1 4-(2-丙炔氧基)苯甲醛(3)

將溴丙炔(0.42 g，3.48 mmol)滴加在對羥基苯甲醛(0.4 g，3.27 mmol)和碳酸鉀(0.87 g，6.32 mmol)的無水DMF(10 mL)混合溶液中，于25 ℃下攪拌12 h。將濾除K2CO3的濾液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，有機相以1 N HCl(aq)、飽和NaHCO3溶液和NaCl水溶液依次洗滌，干燥后減壓蒸餾，得4-(2-丙炔氧基)苯甲醛。無須純化直接用于下一步反應。

2.1.2 3β-[4-醛基苯氧基甲基-(1-氫-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(7)

將3β-疊氮乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(6)[16](0.2 g, 0.32 mmol)和4-(2-丙炔氧基)苯甲醛(56 mg, 0.32 mmol) 溶于CH2Cl2/H2O(1/1, 6 mL)的混合溶劑中，攪拌下依次加入CuSO4·5H2O(28 mg, 0.11 mmol)和抗壞血酸鈉(45 mg, 0.23 mmol)。25 ℃下反應12 h后，減壓蒸餾，粗品以乙酸乙酯稀釋，水洗后無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾，快速柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/5, V/V)純化，得白色固體產(chǎn)物(0.24 g, 94%)。m.p.90～92 ℃;IR(KBr, cm-1): 2947, 1744, 1727, 1694;1H-NMR(300 MHz): 0.60, 0.72, 0.82, 0.88, 0.89, 0.92, 1.11(each 3H, s), 2.90(1H, dd,J=4.6, 14.5 Hz), 4.55～4.60(1H, m), 5.03(1H, d,J=12.5 Hz), 5.09(1H, d,J=12.5 Hz), 5.17(2H, s), 5.27(1H, t), 5.33(2H, s), 7.11(2H, d,J=6.8 Hz), 7.29～7.36(5H, m), 7.78(1H, s), 7.84(2H, d,J=6.8 Hz), 9.89(2H, s);13C-NMR(75 MHz): 190.6, 177.3, 165.7, 163.1, 143.7, 136.4, 131.9, 128.4, 128.0, 127.9, 124.2, 122.2, 115.1, 84.0, 65.9, 62.1, 55.2, 51.2, 47.5, 46.7, 45.8, 41.7, 41.4, 39.3, 38.0, 37.7, 36.8, 33.8, 33.0, 32.6, 32.3, 30.6, 28.0, 27.6, 25.8, 23.6, 23.4, 23.3, 23.0, 18.1, 16.8, 16.5, 15.3;ESI-MS: 812.4[M+H]+。

2.1.3 3β-[4-甲基苯氧基甲基-(1-氫-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸(8)

將上述所得化合物7(81 mg, 0.10 mmol) 溶于四氫呋喃(10 mL)，加入催化量的10%Pd-C。25 ℃下常壓氫化24 h。濾除Pd-C后，減壓蒸餾得粘稠液體。快速柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/4, V/V)純化，得白色固體(36 mg, 51%)。m.p.163～165 ℃;IR(KBr, cm-1): 3349, 2944, 1745, 1692, 1509;1H-NMR(300 MHz): 0.73, 0.74, 0.83, 0.90, 0.91, 0.92, 1.12(each 3H, s), 2.81(1H, d,J=9.8 Hz), 4.55～4.60(1H, m), 5.14(2H, s), 5.22(2H, s), 5.27(1H, t), 6.87(2H, d,J=8.6 Hz), 7.07(2H, d,J=8.6 Hz), 7.73(1H, s);13C-NMR(75 MHz): 183.1, 165.8, 156.1, 142.6, 130.5, 129.9, 123.9, 122.4, 114.6, 83.8, 62.1, 55.2, 51.2, 47.5, 46.5, 45.8, 41.6, 41.0, 39.3, 37.9, 37.7, 36.9, 33.8, 33.0, 32.5, 32.4, 30.6, 28.0, 27.6, 25.8, 23.5, 23.3, 22.9, 20.4, 18.1, 17.0, 16.4, 15.3;ESI-MS: 684.4[M-H]-。

2.2 HepG2細胞葡萄糖消耗作用檢測

2.2.1 實驗方法

參照文獻方法[17], 以胰島素為陽性對照，對目標化合物7和8進行HepG2細胞葡萄糖消耗作用測定實驗。將HepG2細胞以1×105/孔接種于96孔板，用含10%胎牛血清的1640高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞生長至60%融合時，棄培養(yǎng)液。將細胞分為對照組(空白組與胰島素組)和待測化合物組(化合物7組與化合物8組)，其中胰島素濃度為1×10-7mmol/L，待測化合物組濃度為100 μmol/L。同一水平6孔并列，于培養(yǎng)24 h后采用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)液中葡萄糖吸光度以及濃度的變化。通過雙尾學生t-分布檢驗，分別計算空白組與胰島素組、空白組與化合物7組、空白組與化合物8組的葡萄糖吸光度差異，P值<0.05被認為具有統(tǒng)計顯著性。

2.2.2 實驗結(jié)果

兩種OA衍生物對HepG2細胞葡萄糖消耗作用的影響結(jié)果如表1所示，數(shù)據(jù)表明，胰島素組表現(xiàn)符合預期，與空白組相比，胰島素組能夠顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗(P=0.036)，證明本實驗的可靠性。在高糖環(huán)境下，化合物7組和化合物8組在體外預作用24 h后，與空白組相比, 對HepG2細胞的葡萄糖消耗量均起到了促進作用，并增加了細胞對葡萄糖的攝取。值得一提的是，化合物7組能夠顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗(P=0.038)，值得進一步研究。

表1 目標化合物對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響Table 1 Effects of target compounds on glucose consumption of HepG2 cells

a葡萄糖吸光度=平均值±標準差；b以胰島素為陽性對照；cn=6。

3 結(jié) 論

祖國醫(yī)學對女貞子的應用已有上千年的歷史，經(jīng)現(xiàn)代科學研究證實，OA是其主要的活性成分，在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出較好的降血糖活性[18-19]。隨著當今社會人均生活水平的不斷提高，糖尿病已然成為了嚴峻的全球公共衛(wèi)生問題。據(jù)預測，到2045年，全球受到糖尿病的威脅的人數(shù)將會增加到6.93億人[20]。因此，開發(fā)新型有效抗高血糖藥物以滿足不同的臨床用藥需求顯得尤為重要。

本文以OA為先導化合物，通過click化學技術(shù)在OA的C-3位引入1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)，設計并合成得到兩種未見文獻報道的新型OA-1,2,3-三氮唑衍生物并對其結(jié)構(gòu)進行了確證。此外，本文對上述衍生物進行了HepG2細胞葡萄糖消耗測試。結(jié)果表明：OA-1,2,3-三氮唑衍生物具有潛在的降糖作用，為OA-1,2,3-三氮唑衍生物在降糖藥物的研究方面提供了參考數(shù)據(jù)。