酸粥發(fā)酵過(guò)程中微生物群落演替及理化特性變化研究

烏有娜，王玉榮，洋洋，雙全*

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018) 2(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng)，441000)

酸粥是內(nèi)蒙古、山西、陜西和廣西等地的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1-2]，主要以糜米、大米為原料，部分地區(qū)也會(huì)加入玉米糝和面粉等發(fā)酵而成。因其維生素、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分的含量較高而成為一種老少皆宜的谷物發(fā)酵食品[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)酸粥開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)微生物在酸粥發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中起著至關(guān)重要的作用。王玉榮等[4]、張青等[5]使用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酸粥樣品的細(xì)菌多樣性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸粥中細(xì)菌主要是乳桿菌(Lactobacillus)和醋酸桿菌(Acetobacter)。折米娜[6]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酸粥樣品進(jìn)行真菌多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16份樣品中的子囊菌門(mén)(Ascomycota)平均相對(duì)含量高達(dá)97.54%。秦慧彬等[7]使用超高效液相色譜技術(shù)測(cè)定山西酸粥游離氨基酸含量發(fā)現(xiàn)甜味和苦味氨基酸含量較高。薛建崗等[2]、李文亞[8]在酸粥中檢測(cè)到了氨基酸、鈣、磷，并發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的酸粥總氨基酸含量高于未發(fā)酵的糜米。早在2001年陳忠軍[9]已發(fā)現(xiàn)酸粥的獨(dú)特風(fēng)味與乳桿菌、酵母菌具有相關(guān)性。郭昊翔[10]結(jié)合高通量測(cè)序和高效液相色譜技術(shù)對(duì)酸粥的細(xì)菌群落演替和代謝產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭菌屬(Clostridium)和腸球菌屬(Enterococcus)等均與有機(jī)酸、維生素的形成有關(guān)。

高通量測(cè)序作為研究食品發(fā)酵過(guò)程最關(guān)鍵的技術(shù)已經(jīng)得到了快速發(fā)展。Illumina公司的MiSeq測(cè)序技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用到包括辣椒醬[11]、酒窖泥[12]、腐乳[13]、酸馬奶[14]和米酸湯[15]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的核心細(xì)菌類群研究。雖然已有酸粥微生物多樣性與營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)研究[6-10]，但是關(guān)于酸粥發(fā)酵過(guò)程中微生物演替與營(yíng)養(yǎng)成分形成的相關(guān)性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究為了探究酸粥發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落變化，采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間段的酸粥進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)與真菌ITS序列測(cè)序予以探究，同時(shí)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間段氨基酸含量，并監(jiān)測(cè)其各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)酸度、可溶性固形物及蛋白質(zhì)含量變化，使用相關(guān)性分析微生物與氨基酸形成規(guī)律，以期深度了解酸粥自然發(fā)酵過(guò)程。就目前酸粥生產(chǎn)規(guī)模小、產(chǎn)量少等情況[16]，為現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)產(chǎn)品提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糜米(PanicummiliaceumL.)，市售；發(fā)酵引子：2020年8月采集自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市農(nóng)戶家中以糜米和大米為原料自然發(fā)酵24～30 h的酸粥；NaOH、甲基紅乙醇溶液、溴甲酚綠乙醇溶液、HCI、硼酸溶液(20 g/L)、H2SO4(優(yōu)級(jí)純)、CuSO4(分析純)、K2SO4(分析純)、Na2CO3(分析純)，天津福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；UB-7 pH計(jì)，美國(guó)Denver Instrument公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)公司；JY1002電子天平，上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司；L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀，中國(guó)海能公司；GeneAmp?9700型PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸粥的制備與樣本收集

將糜米淘洗瀝干，按照糜米∶水=1∶3(g∶mL)加入蒸餾水，65 ℃水浴30 min。以采集的家庭自制酸粥為引子，按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入冷卻的米湯中，置于30 ℃靜置發(fā)酵48 h，分別在發(fā)酵0、6、12、18、24、30、36、42和48 h取樣，用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

參照GB 5009.237—2016使用pH計(jì)測(cè)定樣品的pH值；使用全自動(dòng)折光儀測(cè)定樣品的可溶性固形物含量；參照GB 5009.5—2016使用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)含量；參照GB 5009.5—2016 (第一法)測(cè)定樣品的氨基酸含量。以上指標(biāo)每個(gè)樣品平行3次。

1.3.3 酸粥細(xì)菌和真菌Illumina MiSeq測(cè)序

完成酸粥發(fā)酵液中基因組DNA提取并利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，細(xì)菌與真菌分別以338F/806R，ITS3F/ITS4R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。測(cè)序由上海美吉生物科技有限公司完成。

測(cè)序得到雙端序列數(shù)據(jù)后，將成對(duì)的reads 拼接成一條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的標(biāo)簽序列和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。參照崔夢(mèng)君等[17]的方法，采用QIIME(v1.70)平臺(tái)，將有效序列以97%的相似度進(jìn)行分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)劃分后進(jìn)行同源性比對(duì)，從而確定細(xì)菌和真菌的從門(mén)至屬水平的分類學(xué)地位，并且進(jìn)行α多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，當(dāng)P<0.05時(shí)組間差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)組間差異極顯著。使用Origin 2021進(jìn)行結(jié)果可視化。相關(guān)性分析選擇Spearman系數(shù)，利用微科盟生科云平臺(tái)(https://www.bioincloud.tech/)繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化特性分析

如圖1-a所示，發(fā)酵過(guò)程中pH值整體呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵0～24 h由4.09快速降至3.26，達(dá)到自然發(fā)酵酸粥酸度[18]，隨后下降趨勢(shì)放緩，發(fā)酵前期pH值迅速下降的原因可能是產(chǎn)酸微生物在此階段較為活躍，代謝旺盛，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的pH值在3.12～4.09，能夠抑制有害菌的生長(zhǎng)，保證酸粥的品質(zhì)。酸粥蛋白質(zhì)含量的整體變化趨勢(shì)較小(圖1-b)，從發(fā)酵開(kāi)始就快速積累，直至48 h時(shí)達(dá)到峰值0.36 g/100 g，與郭昊翔等[19]的結(jié)果相似，微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌大量的蛋白質(zhì)可能是其含量增加的原因。發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物含量變化呈現(xiàn)出與蛋白質(zhì)含量相同的變化規(guī)律，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)整體上隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸升高。

a-pH;b-蛋白質(zhì)和可溶性固形物圖1 酸粥發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of physicochemical characteristics of congee during fermentation

氨基酸在發(fā)酵過(guò)程中可被酵母利用，參與酸粥中的風(fēng)味物質(zhì)的合成。從酸粥9個(gè)采樣點(diǎn)樣品中共檢測(cè)到16種氨基酸，其中谷氨酸與天冬氨酸含量最高，且2種氨基酸是鮮味氨基酸，使食品具有更優(yōu)良的感官特性。酸粥中乳酸菌的含量較高[8-9]，并且已知乳酸菌可以促進(jìn)谷氨酸和天冬氨酸的釋放[20]，所以導(dǎo)致樣品中2個(gè)氨基酸含量最高的原因可能是乳酸菌。從圖2可以看出，在酸粥發(fā)酵前42 h隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)多數(shù)氨基酸逐漸增加，精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸在發(fā)酵過(guò)程中的變化較為顯著。各氨基酸的含量在發(fā)酵前期與中期不斷增加，在42 h時(shí)減少，但在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)達(dá)到最高值，48 h時(shí)總氨基酸含量增加至發(fā)酵前(0 h)的2倍。發(fā)酵48 h時(shí)的必需氨基酸與總氨基酸的比例為39%，接近于聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織推薦的蛋白質(zhì)中必需氨基酸占總氨基酸的百分比[8]，表明酸粥發(fā)酵可改善原料營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，提升其利用率。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中酸粥氨基酸含量的變化Fig.2 Changes of amino acid content in congee during fermentation

2.2 酸粥發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 酸粥微生物α-多樣性分析

不同發(fā)酵時(shí)間段的酸粥樣品16S rRNA序列測(cè)序結(jié)果共產(chǎn)生738 355條有效序列，ITS序列測(cè)序后共產(chǎn)生1 271 953條有效序列，進(jìn)一步對(duì)有效序列進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。發(fā)酵前6 h細(xì)菌的Chao 1指數(shù)顯著增加，真菌的卻略有下降，可能是由于細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中釋放出乳酸、乙酸等物質(zhì)抑制了真菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵30 h開(kāi)始，Chao 1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均有上升趨勢(shì)，可能是一些真菌隨著發(fā)酵逐漸適應(yīng)環(huán)境，能夠利用殘留物質(zhì)進(jìn)行繁殖。在發(fā)酵48 h時(shí)微生物多樣性與豐富度指數(shù)達(dá)到最高值，表明通過(guò)發(fā)酵細(xì)菌和真菌多樣性與豐富度均得到提升。另外可以發(fā)現(xiàn)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌Chao 1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)大于真菌，說(shuō)明酸粥的細(xì)菌物種多樣性與豐富度均大于真菌。

表1 發(fā)酵過(guò)程中酸粥細(xì)菌和真菌α-多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity index of bacteria and fungi in fermented congee

2.2.2 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特性分析

經(jīng)過(guò)與物種數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分別獲得了從門(mén)至屬水平的物種分類信息。由圖3-a可知，酸粥細(xì)菌主要由厚壁菌門(mén)(Firmicutes，91.56%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，8.14%)與放線菌門(mén)(Actinobacteria，0.03%)構(gòu)成。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度雖然有所浮動(dòng)，但在48 h時(shí)的含量仍為最高，相對(duì)豐度為93.24%。Proteobacteria在發(fā)酵前12 h時(shí)達(dá)到峰值23.82%，隨后呈現(xiàn)較小浮動(dòng)，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的豐度為6.49%。由此可知，F(xiàn)irmicutes為酸粥的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，郭昊翔[10]使用MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)酸粥細(xì)菌菌群的變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)Firmicutes為發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。

在屬水平下檢測(cè)到的相對(duì)豐度大于0.1%的細(xì)菌屬有隸屬于Firmicutes的乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)，隸屬于Proteobacteria的小坂菌屬(Kosakonia)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)和歐文氏菌屬(Erwinia)等。在發(fā)酵6～12 h時(shí)細(xì)菌多樣性最高，與α-多樣性分析結(jié)果一致。酸粥發(fā)酵過(guò)程中的Lactobacillus平均相對(duì)豐度為91.53%，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，與王玉榮等[21]、王成等[22]的結(jié)果一致。Lactobacillus在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生以乳酸為主的有機(jī)酸，以降低發(fā)酵液的pH值來(lái)抑制其他微生物生長(zhǎng)[23]。Kosakonia、Enterococcus和Erwinia均有先增加后減少的趨勢(shì)，可能是由于Lactobacillus所產(chǎn)生的乳酸桿菌素抑制其生長(zhǎng)[24]。由此可知，Lactobacillus在保證酸粥品質(zhì)方面起著重要的作用。

a-門(mén)水平；b-屬水平圖3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig.3 Structure of bacterial community on phylum level and genus level

2.2.3 真菌菌群結(jié)構(gòu)特性分析

酸粥發(fā)酵過(guò)程中的真菌群落結(jié)構(gòu)變化如圖4-a所示，優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)為子囊菌門(mén)(Ascomycota)和Anthophyta。Ascomycota在發(fā)酵初期的相對(duì)豐度為98.53%，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加其含量呈較小浮動(dòng)，在發(fā)酵48 h時(shí)下降至91.36%。Anthophyta初始豐度為1.41%，48 h顯著增加至8.39%。雖然隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)Ascomycota的豐度有所下降，但是其豐度均大于90%，為酸粥發(fā)酵過(guò)程中的主要真菌門(mén)，與折米娜[6]的結(jié)果一致。

在屬水平上，雙足囊菌屬(Dipodascus)與耶氏酵母屬(Yarrowia)為優(yōu)勢(shì)菌屬，在各發(fā)酵時(shí)間的平均相對(duì)豐度分別為47.12%和48.22%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行其相對(duì)豐度略有下降。雖然畢赤酵母屬(Pichia)含量微弱，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其相對(duì)豐度卻有所增加，從0.47%增加至1.63%。王玉榮等[4]從內(nèi)蒙古鄂爾多斯酸粥中分離鑒定出Yarrowia與Pichia。MENDON?A等[25]發(fā)現(xiàn)Yarrowia與蛋白水解活性有關(guān)。童敏江等[26]對(duì)汾酒主要功能微生物進(jìn)行單菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pichia具有產(chǎn)乙酸乙酯作用。Dipodascus尚未在酸粥中被發(fā)現(xiàn)，鮑奕達(dá)等[27]在郫縣豆瓣樣品中檢測(cè)到該菌屬并發(fā)現(xiàn)其與氨基酸轉(zhuǎn)胺后的產(chǎn)物具有相關(guān)性，因此推測(cè)該菌屬可能與氨基酸分解代謝有關(guān)，可能是潛在的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生菌。

a-門(mén)水平；b-屬水平圖4 真菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Structure of fungal community on phylum level and genus level

2.3 微生物與理化指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性分析

理化因子與核心微生物屬間的Spearman相關(guān)系數(shù)的結(jié)果表明(圖5)，Lactobacillus、Klebsiella、Kosakonia、Ralstonia、Erwinia、Yarrowia和Dipodascus與pH正相關(guān)，與氨基酸負(fù)相關(guān)，可見(jiàn)酸性環(huán)境抑制部分微生物的生長(zhǎng)。Pichia與大多數(shù)理化特性呈正相關(guān)，包括蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蛋白質(zhì)和可溶性固形物。任宇婷等[28]通過(guò)對(duì)廣西地區(qū)酸粥細(xì)菌菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)酸粥中存在的Pichia與氨基酸代謝有關(guān)，因此推測(cè)總氨基酸在42 h時(shí)突然下降的原因也可能是Pichia在此發(fā)酵階段的豐度最高。Pichia與pH呈負(fù)相關(guān)，可能是由于其生長(zhǎng)pH值比較寬(pH 3～7)，且較適宜酸性環(huán)境，因此在一定范圍內(nèi)pH值越小、酸度越大，越適宜Pichia的生長(zhǎng)。

注：正相關(guān)和負(fù)相關(guān)分別用紅色和藍(lán)色表示圖5 酸粥核心微生物與理化特性的相關(guān)性Fig.5 Correlation between physicochemical indicators and microbial diversity in fermented congee

3 結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序方法分析不同發(fā)酵時(shí)間段酸粥的微生物變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程以隸屬于Firmicutes的Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，優(yōu)勢(shì)真菌屬為Yarrowia、Dipodascus和Pichia。對(duì)酸粥理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，通過(guò)發(fā)酵酸粥pH下降，蛋白質(zhì)、可溶性固形物均有所上升，pH值的下降有效抑制了部分條件致病菌的生長(zhǎng)。氨基酸作為揮發(fā)性風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中亦呈上升趨勢(shì)，且氨基酸組成更為合理。對(duì)酸粥微生物群落與理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH和氨基酸對(duì)酸粥微生物群落有較大影響，因此控制酸粥發(fā)酵酸度對(duì)產(chǎn)品安全性與風(fēng)味有著至關(guān)重要的作用。