基于全基因組測序的黃水芽胞桿菌Bacillus aquiflavi 3H-10安全性評價

程坤，劉蕊，孫思佳，翟磊，鄭佳，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)

安全性是微生物菌種應用于工業生產的重要前提，抗生素耐藥性、產毒與致病性是評價菌種安全性的重要方面。2002年，聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)/世界衛生組織(World Health Organization，WHO)發布的適用于食品用益生菌的評估指南要求：對于食品用益生菌，應考慮菌種在抗生素耐藥性、特定代謝活性物質、人體副作用、有害事件的流行病監測以及毒素產生等方面的安全性；任何給定的益生菌在抗生素耐藥性轉移、機會性毒力方面不應存在重大風險[1]。歐盟“安全資格認證(Qualified Presumption of Safety，QPS)”評價程序[2]和美國“一般認為安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)”認證[3]同樣強調了針對微生物菌種應開展抗生素耐藥性、產毒與致病性分析，以評估其安全性。隨著基因測序技術的不斷更迭，人們對菌種安全性的理解也在不斷發生變化和趨于完善。2020年益生菌的科學共識中指出，對于新屬種的益生菌菌株，應通過全基因組測序生物信息分析闡述評估其所攜帶的耐藥基因、致病基因等特征[4]。基于基因測序技術的生物信息學分析能夠篩查菌種中與抗生素耐藥、毒力和致病性等相關的基因，挖掘菌種潛在安全性風險的遺傳機制，為評價微生物菌種的安全性提供一種便捷手段。

目前，芽胞桿菌屬(Bacillus)內已有多個物種被列入歐盟QPS名單[5]和國際乳品聯合會IDF 495—2018《發酵食品用微生物菌種調查及安全性聲稱》公報[6]，被證明是安全的。在我國，尚無芽胞桿菌物種被列入《可用于食品的菌種名單》，但該屬內多個物種曾被報道用于我國傳統發酵食品中[7]，芽胞桿菌新菌種在使用前需進行全面的安全性評價。黃水芽胞桿菌Bacillusaquiflavi3H-10是從我國四川省宜賓地區傳統發酵濃香型白酒黃水樣品中分離的1株新種菌株[8]，可產生蛋白酶以及苯甲醛、2,5-二甲基吡嗪、己酸乙酯等多種風味物質(暫未發表)，在白酒發酵實際生產中具有應用潛力。本文通過測定黃水芽胞桿菌3H-10的基因組完成圖序列，針對抗生素耐藥性、產毒與致病性開展相關安全性基因分析，并結合抗生素敏感性試驗和小鼠毒力試驗，對黃水芽胞桿菌3H-10的安全性進行綜合評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

本研究所用菌種黃水芽胞桿菌3H-10(=CICC 24755T)，中國工業微生物菌種保藏管理中心，前期由本實驗室分離自我國四川省宜賓地區傳統發酵濃香型白酒的黃水樣品[8]；所用培養基為大豆酪蛋白TSB培養基、大豆酪蛋白瓊脂TSA培養基。

1.1.2 儀器與設備

隔水式培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Eppendorf微量可調移液器、5424R小型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；HG-50高壓滅菌鍋，日本 HIRAYAMA公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；BioDrop核酸蛋白分析儀，豪沃生物科技(上海)有限公司；Qubit 3.0核酸熒光定量儀，美國ThermoFisher Scientific公司；Hiseq2500基因測序儀，美國Illumina公司；PacBio Sequel基因測序儀，美國PacBio公司。

1.1.3 試劑

TSA瓊脂，美國BD公司；溴代十六烷基三四胺(cetyl trimethyl ammonicum bromide，CTAB)、Tris-飽和酚，美國Sigma公司；氯仿，北京市通廣精細化工公司；異戊醇，西隴化工股份有限公司；異丙醇，北京化工廠；λDNA/Hind Ⅲ分子量標記、Qubit dsDNA HS Assay Kit試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司；GoldView、瓊脂糖，北京全式金生物技術有限公司；抗生素E-test藥敏紙片，法國生物梅里埃公司；SPF級ICR小鼠(許可證編號SCXK(京)2016-0006)，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株DNA提取及質檢

取TSB于37 ℃ 200 r/min培養3 d的菌懸液，8 000 r/min離心收集約1 g濕菌體至1.5 mL離心管中，加入600 μL CTAB裂解液，65 ℃水浴45 min，13 000 r/min離心10 min；取上清液于一新離心管中，加入等體積的V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，充分混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液，加等體積的V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，充分混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液，加等體積的預冷異丙醇試劑，-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心20 min；收集沉淀，75%乙醇沖洗，室溫放置使DNA干燥；使用100 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存備用。使用Qubit 3.0核酸熒光定量儀測定DNA樣本濃度；使用BioDrop核酸蛋白分析儀測定DNA樣品的A260/A280和A260/A230值，判斷DNA純度。

1.2.2 DNA測序、數據質控與組裝

采用Illumina Hiseq 2500基因測序儀和Pacbio Sequel基因測序儀分別進行小片斷和大片斷文庫測序。對原始下機數據進行如下質控過濾：去除質量值連續≤20的堿基數達到40%的reads、去除含N堿基比例≥10%的reads、去除接頭和重復污染。采用proovread v2.12軟件對下機數據進行糾錯，并采用Falcon v0.3.0和GATK v6-13軟件分別進行序列組裝和單堿基糾錯，得到高質量的基因組完成圖。

1.2.3 基因預測與注釋

采用Glimmer v3.02軟件對組裝結果進行基因預測，預測基因序列與COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數據庫進行比對，獲得相應基因的注釋信息。

1.2.4 耐藥基因檢測

通過與Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)[9]和ResFinder[10]數據庫比對，檢測菌株基因組中的潛在耐藥基因。通過RGI軟件將預測基因的氨基酸序列與CARD數據庫的比對，以“perfect”和“strict”算法輸出結果作為耐藥基因的檢測結果；與ResFinder數據庫比對時，設置序列相似性≥90%，序列覆蓋度≥60%。

1.2.5 毒力基因檢測

通過與Virulence Factors of Pathogenic Bacteria (VFDB)[11]和VirulenceFinder[12]數據庫比對，檢測菌株基因組中的潛在毒力基因。與VFDB數據庫比對時，使用的軟件為diamond，E值≤e-5，序列相似性≥70%，序列覆蓋度≥70%；與VirulenceFinder數據庫比對時，設置序列相似性≥90%，序列覆蓋度≥60%。

1.2.6 抗生素敏感性測定

使用生理鹽水制備并調整菌懸液至0.5麥氏濁度，使用無菌拭子沾取菌懸液并均勻涂布于CAMHB固體平板上，待瓊脂表面干燥后，使用無菌鑷子取抗生素E-test試劑條置于平板表面，37 ℃培養72 h，觀察結果。橢圓形抑菌環與E-test試條的交界點藥物濃度即為最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。根據美國臨床和實驗室標準協會CLSI M45—2016《Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria:approved guideline》[13]共選取10種、9類常見抗生素用于藥物敏感性實驗。菌種耐藥性的判斷標準參照歐盟指南《Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms》[14]與CLSI M45—2016[13]。質控菌株為金黃色葡萄球菌CICC 10473T(=ATCC 29213T)。

1.2.7 小鼠毒力試驗

將菌種轉接于TSB培養基中，置于37 ℃，好氧培養72 h至計數約108CFU/mL，作為培養物原液備用。取部分培養物原液濃縮5倍，作為培養物5倍濃縮液備用。選用SPF級ICR小鼠80只，雌雄各半，在北京維通利華實驗動物技術有限公司動物房[許可證編號為SYXK(京)2017-0022]飼養。雄性小鼠體重16.0～25.0 g，雌性小鼠體重16.0～25.0 g。ICR小鼠80只，雌雄各半，分別隨機分為4組，每組10只。劑量組設置為：培養基原液對照組，培養物原液組，培養基5倍濃縮對照組，培養物5倍濃縮組。將受試物以20.0 mL/kg BW劑量給小鼠連續灌胃3 d，觀察7 d，記錄實驗過程中小鼠的體重變化、中毒表現及死亡情況。使用SPSS 18.0軟件進行數據分析，培養物組與對照組間定量資料的比較用兩樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 黃水芽胞桿菌3H-10全基因組概況

通過Illumina和PacBio平臺分別測序獲得569×和788×原始下機數據，經數據質控過濾與拼接，獲得菌株3H-10的基因組信息。其基因組為一條共價閉合環狀的DNA(圖1-a)，大小3 806 094 bp，G+C含量為35.66%(摩爾百分含量)。基因組中共預測到4 031個蛋白質編碼基因、81個tRNA基因、各9個5S/16S/23S rRNA基因、16個sRNA基因。通過與多個數據庫進行比對，最終注釋基因3 324個。黃水芽胞桿菌3H-10的基因組大小與G+C含量符合芽胞桿菌屬物種基因組的一般特征[15]。與近緣物種基因組相比，黃水芽胞桿菌3H-10在基因組大小和G+C含量等方面與WeizamanniaginsengihumiGsoil 114T較相似(表1)。

a-菌株3H-10基因組圈圖，從外到內8圈依次代基因組大小、預測基因、正鏈基因、負鏈基因、tRNA、rRNA、sRNA、GC含量和GC偏移； b-菌株3H-10預測基因COG功能分類圖1 黃水芽胞桿菌3H-10的基因組完成圖與預測基因COG功能分類Fig.1 Circos plot for the complete genome of B.aquiflavi 3H-10 and the COG function classification of the predicted genes

對黃水芽胞桿菌3H-10基因功能進行分析，利用COG進行基因注釋與功能分類，共注釋基因2 385個(59.16%)，可分為24個功能組(圖1-b)，其中預測為一般功能基因分組最多。黃水芽胞桿菌3H-10基因組中涉及氨基酸運輸與代謝，翻譯、核糖體結構與生物合成，轉錄、輔酶轉運與翻譯、脂轉運與代謝，能量產生與轉換等的注釋基因數相對較多，在150～250。通過與KEGG數據庫進行比對發現，菌株3H-10中存在較完整的氨基酸、脂類、碳水化合物、輔因子與維生素的代謝途徑，并包含對芳香族、萜類和聚酮等化合物的降解途徑，推測菌株3H-10具有產生多種次級代謝產物的能力，這可能與白酒釀造中豐富的風味物質形成相關。

表1 黃水芽胞桿菌3H-10及其近緣物種基因組的基本特征Table 1 Basic information of the assembled genomes of B.aquiflavi 3H-10 and closely relatives

2.2 耐藥性分析

2.2.1 耐藥基因分析

抗生素依據其化學結構可歸為多種類別，包括常見的氨基糖苷類、β-內酰胺類、氟喹諾酮類、葉酸途徑拮抗劑、磷霉素類、糖肽類、林可酰胺類、大環內酯類、硝基咪唑類、多粘菌素類、假單胞菌酸類、利福霉素、鏈陽霉素類、四環素類、苯丙醇類和磺胺類等。目前，針對常見抗生素已有大量抗生素耐藥基因被報道(表2)，并收錄到相關耐藥基因數據庫中。CARD和ResFinder數據庫是關于耐藥基因及其產物和相關表現型的生物信息學數據庫，涵蓋了當前已發現的多數抗生素耐藥基因[9-10]。通過將黃水芽胞桿菌3H-10的基因組序列與這兩個數據庫比對，均未檢測到上述耐藥基因(表2)。

青海將建立健全住房公積金管理部門及人社、財政、工商、稅務、工會等部門聯合監管機制，對本行政區域內單位不繳存住房公積金或不為職工設立公積金賬戶、少繳、欠繳等行為，按照《住房公積金管理條例》規定給予行政處罰或申請人民法院強制執行。

表2 常見抗生素、耐藥基因及黃水芽胞桿菌3H-10在耐藥基因數據庫的比對結果Table 2 Common antibiotics, antimicrobial resistance genes and the analysis result of the genome of B.aquiflavi 3H-10 against related antimicrobial resistance databases

2020年CHINET中國細菌耐藥監測顯示，臨床分離菌株對常見抗菌藥物的耐藥率呈現增長趨勢。芽胞桿菌在自然界中廣泛分布，其生存環境包括土壤、水、食物及臨床等。該屬中常見的耐藥基因包括氨基糖苷類耐藥基因ant(4′)-Ib、aph(3′)-III和aph(3′)-IV，氯霉素耐藥基因cat86和fexA，紅霉素耐藥基因ermD、ermK和erm34，四環素耐藥基因tetK、tetL、tetM、tetW和tet42、桿菌肽耐藥基因bacA和bcrA等[18-19]。通過基于序列比對的靶向分析，在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中未檢測到這些基因。

2.2.2 抗生素敏感性測定

檢測結果顯示，菌株黃水芽胞桿菌3H-10對所選全部抗生素，即青霉素、美羅培南、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、四環素、環丙沙星、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、氯霉素、利福平，均敏感(表3)。實驗所用9類、10種抗生素依據CLSI M45—2016[13]選取，基本覆蓋世界衛生組織所發布《對人類醫學至關重要的抗微生物藥物》中重要抗生素大類，其中頭孢菌素類(第三代、四代和五代)、糖肽類、大環內酯類和酮內酯類、多粘菌素類、喹諾酮類被列為最高優先至關重要抗微生物藥物[20]。芽胞桿菌目前未被列入世界衛生組織[21]和我國CHINET對細菌耐藥性監控的微生物之列；有研究報道，部分芽胞桿菌對鏈霉素、克林霉素、氯霉素、卡那霉素、紅霉素、四環素具有耐藥性[18-19]。抗生素敏感性試驗顯示，菌株3H-10對常見重要抗生素無耐藥性，這與該菌株基因組中未檢測到相關耐藥基因的結果一致。綜合耐藥基因型與表型結果可見，黃水芽胞桿菌3H-10自身無橫向傳播耐藥性或耐藥基因的風險。

表3 黃水芽胞桿菌3H-10對常見抗生素的敏感性檢測結果Table 3 Antimicrobial susceptibility test result of B.aquiflavi 3H-10 to common antibiotics

2.3 毒力分析分析

2.3.1 毒力基因分析

毒力是菌種安全性評價的重要方面。細菌的毒力因子主要可分為4大類：與宿主黏附和入侵相關、細菌分泌系統和效應物、毒素以及鐵離子系統[11]。VFDB和VirulenceFinder數據庫收錄了當前已報道的大量細菌毒力因子基因序列[11-12]，被國內外與菌種安全評價相關的多個標準和指南所推薦。通過將黃水芽胞桿菌3H-10的基因組序列與這兩個數據庫進行比對，未檢測到上述毒力基因(表4)。

表4 黃水芽胞桿菌3H-10基因組中毒力基因的檢測結果Table 4 Detection of virulence genes in the genome of B.aquiflavi 3H-10

在芽胞桿菌中，蠟樣芽胞桿菌常被報道攜帶毒力基因，包括與嘔吐毒素相關的非核糖體多肽合成酶系(NRPS)基因、與腹瀉毒素相關的溶血素BL基因、非溶血性的腸毒素Nhe基因(nheA、nheB、nheC)、腸毒素FM基因(entFM)、腸毒素T基因(bceT)和細胞毒素K基因(cytK)[22-23]。通過基于序列比對的靶向分析，在3H-10基因組中未檢測到這些毒力基因。

小鼠毒力試驗是目前檢測菌株是否存在安全風險最直接、有效的生理學證據，在我國食品、保健食品、飼料等領域微生物安全性評價中占有重要地位。我國《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術指導原則》(2020年版)、《食品安全國家標準食品用菌種安全性評價程序(征求意見稿)》、《TCSWSL 016—2019 水產動物飼用乳酸菌篩選標準》、《團體標準TCSWSL 017—2019 水產動物飼用芽孢桿菌篩選標準》等均要求針對菌種開展小鼠毒力試驗。本文利用菌株黃水芽胞桿菌3H-10培養原液和5倍濃縮液對SPF級ICR小鼠進行灌喂，觀察菌種對小鼠體重、毒性反應的影響。表5和表6分別顯示3H-10培養物對雄、雌小鼠體重的影響，可見雄、雌性小鼠的初始體重和終體重在培養物組與其相應對照組間比較均無顯著性差異(P>0.05)，即在試驗期間菌株3H-10培養物對雄、雌性小鼠的體重無影響。

表5 黃水芽胞桿菌3H-10培養物對雄性小鼠體重的影響Table 5 Effect of B.aquiflavi 3H-10 culture to weight of male mice

表6 黃水芽胞桿菌3H-10培養物對雌性小鼠體重的影響Table 6 Effect of B.aquaflavi 3H-10 culture to weight of female mice

表7為菌株3H-10培養物對小鼠急性毒性的影響。結果顯示，將菌株3H-10培養物原液和5倍濃縮液，以20.0 mL/kg BW的劑量給小鼠連續灌胃3 d，觀察7 d，未觀察到受試小鼠有毒性反應或死亡。結合毒力基因與小鼠毒力試驗結果可見，菌株3H-10自身無毒力或致病性風險。

表7 黃水芽胞桿菌3H-10培養物對小鼠急性毒性作用Table 7 Acute toxicity effect of B.aquiflavi 3H-10 culture to mice

3 結論

近年來，高通量測序技術飛速發展，基因組測序逐漸成為微生物鑒定、分型溯源和功能挖掘等分析中的常規手段，也使得從基因層面評估菌種的安全性、解析風險因素的遺傳機制成為可能。目前，國內外已有多個關于抗生素耐藥基因、毒力與致病基因的數據庫。其中，CARD是關于耐藥基因及其產物和相關表現型的生物信息學數據庫，于2013年由加拿大McMaster大學開發[9]。目前包含263種病原菌，14 795個WGS拼接序列，175 753條等位序列，覆蓋與28類、336種抗生素相關的3 014條耐藥基因序列。ResFinder數據庫于2012年由丹麥技術大學開發與維護，目前包括與27類、127種抗生素相關的2 817條耐藥序列[10]。VFDB數據庫由中國醫學科學院和中國協和醫科大學于2005年建立，目前包括74種病原菌屬、951株細菌、1 284種毒力因子、32 827條毒力相關基因序列[11]。VirulenceFinder由丹麥技術大學開發，覆蓋4種常見致病菌(李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和腸球菌)中與7種主要毒力因子相關的502種毒力基因[12]。這些與安全性相關數據庫為篩查菌種全基因組序列中的耐藥、毒力與致病性等風險基因提供了重要的數據基礎，具有重要應用價值。SULTHANA等[24]對枯草芽胞桿菌BacillussubtilisUBBS-14進行全基因組測序和基因安全性評價，發現該菌株不攜帶任何含抗生素耐藥性基因的質粒，不包含任何推定的有害毒力因子編碼基因，從而在基因組水平上證實了該菌株作為益生菌的安全性。SAROJ等[25]對凝結芽胞桿菌BacilluscoagulansLBSC (DSM 17654)進行全基因組測序，并對耐藥基因、產生物胺、毒力因子基因等安全相關基因開展分析，從分子水平上證明該菌株的安全性。基因安全性分析是菌種安全性評價的重要方面，與抗生素敏感性、小鼠毒力試驗等傳統分析方法有機結合、互為補充，可實現對工業用菌種全面而系統的安全性評價。

本研究對分離自我國四川省宜賓地區的黃水芽胞桿菌3H-10進行全基因組測序，并開展基于基因型與表型的抗生素耐藥性、毒力與致病性分析，全面評價菌種的安全性。黃水芽胞桿菌3H-10基因組中不含有耐藥基因，對常見抗生素敏感；基因組中無毒力相關基因，受試小鼠不產生毒性反應或死亡反應。因此推測，菌株3H-10無橫向轉移耐藥基因的風險，無毒力或人體致病性。黃水芽胞桿菌3H-10分離自我國傳統發酵濃香型白酒黃水樣品，前期研究發現其具有較好的產蛋白酶活性，并可產生多種次級代謝風味物質，在濃香型白酒發酵中具有一定應用潛力。本研究對黃水芽胞桿菌3H-10在抗生素耐藥性、毒力與致病性方面的安全性評估，為該菌株在濃香型白酒發酵中的實際應用奠定了良好基礎。