靜脈血栓栓塞患者循環細胞外DNA 變化及其臨床意義

張元莉 路彩霞 董素敏 孫美蘭

1.石家莊市人民醫院心血管內科二病區，河北石家莊 050011；2.河北省滄州中西醫結合醫院急診科，河北滄州 061000；3.河北省滄州中西醫結合醫院介入血管外科，河北滄州 061000；4.石家莊市人民醫院建安病區，河北石家莊 050011

靜脈血栓栓塞癥是指血液在靜脈中的不正常凝結，使靜脈管腔阻塞，導致靜脈回流障礙，主要包括肺血栓栓塞和深靜脈血栓栓塞，是繼腦卒中和心肌梗死后第三大常見的心腦血管疾病[1-2]。靜脈血栓栓塞癥發病隱匿，80%左右的患者臨床癥狀不明顯，有高誤診率、高漏診率的特點[3]，且血栓形成后極少數能自行消融，大多會逐漸演變為血栓形成后遺癥，長期影響患者的生活質量，嚴重者可導致死亡[4-5]。因此，尋找靜脈血栓栓塞癥的有效評估指標以指導臨床治療、改善預后是臨床亟須解決的問題。有研究發現，中性粒細胞外誘捕網與靜脈血栓栓塞有著密切的關系，其獨特的網狀結構可為血栓的形成提供支架，促進血栓形成[6]。而血漿中游離脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是中性粒細胞外誘捕網的主要成分，有研究報道老年骨折深靜脈血栓栓塞患者的循環DNA 水平明顯高于骨折未并發深靜脈血栓栓塞患者[7]，提示循環DNA 可能在深靜脈血栓栓塞形成中有著重要作用。基于此，本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測靜脈血栓栓塞癥患者循環細胞外DNA 水平，并探討其與靜脈血栓栓塞癥病情嚴重程度的關系，旨在為臨床評估治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經醫院倫理委員會審批后（批準文號：201904-002），選取石家莊市人民醫院（以下簡稱“我院”）2019 年5 月至2021 年5 月收治的107 例靜脈血栓栓塞患者作為疾病組，同期選取我院體檢科110 名健康體檢者作為對照組。對照組男69 例，女41 例；年齡45～73 歲，平均（57.36±5.18）歲。疾病組男65 例，女42 例；年齡46～73 歲，平均（56.14±5.21）歲；肺血栓栓塞23 例，深靜脈血栓栓塞84 例，其中深靜脈血栓栓塞發生左下肢57 例、右下肢24 例、雙下肢3 例；合并冠心病10 例，合并高血壓36 例，合并糖尿病14 例。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標準：①疾病組符合深靜脈血栓形成[8]和肺栓塞診斷標準[9]；②對照組經體檢確認健康；③年齡18～75 歲；④患者及家屬對本研究知情并簽署知情書。

排除標準：①有腎衰竭、肝硬化等重大器官疾病；②患惡性腫瘤；③已使用過溶栓、抗凝類藥物；④有血液系統性疾病；⑤免疫性疾病及急性感染。

1.2 循環細胞外DNA 水平的檢測

血漿樣本的采集：于對照組體檢當日、疾病組治療前采集空腹外周無菌靜脈血5 ml 于EDTA 抗凝采血管（北京科美信生物有限公司）中，將血樣置于TDL-5-A 低速離心機（上海儀天科學儀器有限公司）3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，棄去上層血清，再于TGL-16G 高速離心機（上海儀天科學儀器有限公司）中12 000 r/min 離心10 min，離心半徑15 cm，將血漿分裝為每管200 μl，統一儲存于-80℃冰箱中。

循環DNA 水平的測定：取以上200 μl 血漿樣本解凍，按照血漿DNA 提取試劑盒（美國Epigentek 公司，貨號：70404-20）的說明進行操作提取DNA，加入180 μl 熒光染料工作液混勻，另取10 μl DNA 濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提供的標準品溶液與190 μl 熒光染料工作液混勻。用Varioskan LUX 多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）進行測定（激發光波長480 nm，發射光波長530 nm），根據建立的標準曲線和標準品的熒光值計算出樣品中的游離DNA 濃度。

1.3 病情嚴重程度判定

肺血栓栓塞嚴重程度判定：采用CT 肺動脈造影檢查，將動脈阻塞程度＜25%、≥25%且＜50%、≥50%且＜75%、≥75%且＜100%、100%分別分為1～5 級，各級的分值分別為1～5 分，統計1～5 級阻塞程度的總分，計算肺動脈指數（pulmonary artery index，PAOI），PAOI=（1～5 級阻塞程度的總分）/155。按照相關標準[10]，根據PAOI 將肺血栓栓塞患者分為輕度組：PAOI＜30%；中度組：30%≤PAOI＜50%；重度組：PAOI≥50%。

深靜脈血栓栓塞嚴重程度判定[11]：血管腔沒有被壓扁者得2 分，部分壓扁者得1 分，完全被壓扁者得0 分；血管腔血流完全缺損者得2 分，部分出現缺損者得1 分，血流充盈者得0 分；頻譜形態出現明顯異常者得2 分，部分異常者得1 分，頻譜形態正常者得0 分。總分≤2 分為輕度，3～4 分為中度，≥5 分為重度。

1.4 觀察指標

比較兩組血漿循環細胞外DNA 水平；比較疾病組不同嚴重程度患者血漿循環細胞外DNA 水平；分析循環細胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞嚴重程度的關系。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗；計數資料采用例數和百分率表示，比較采用χ2檢驗；采用Spearman 秩相關分析循環細胞外DNA水平與靜脈血栓栓塞嚴重程度的關系。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血漿循環細胞外DNA 水平比較

疾病組血漿循環細胞外DNA 水平高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血漿循環細胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

表1 兩組血漿循環細胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

2.2 疾病組不同嚴重程度患者血漿循環細胞外DNA水平比較

疾病組107 例靜脈血栓栓塞癥患者中，輕度栓塞51 例，中度栓塞43 例，重度栓塞13 例。三組循環細胞外DNA 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。中度組和重度組循環細胞外DNA 水平均高于輕度組，重度組循環細胞外DNA 水平高于中度組（P＜0.05）。見表2。

表2 疾病組不同嚴重程度患者血漿循環細胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

表2 疾病組不同嚴重程度患者血漿循環細胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

注 與輕度組比較，aP＜0.05；與中度組比較，bP＜0.05

2.3 循環細胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞嚴重程度的關系

Spearman 秩相關分析結果顯示，循環細胞外DNA水平與靜脈血栓栓塞嚴重程度呈正相關（r=0.866，P＜0.05）。

3 討論

靜脈血栓栓塞癥對人類健康有著嚴重的威脅。據西方國家的相關統計，每16 秒就有一個人發生靜脈血栓栓塞，每年死亡人數超過80 萬人[12-13]。靜脈血栓栓塞患者癥狀表現輕重不一，缺乏特異性，目前多普勒超聲以無創、易行的特點在臨床中應用最多，但不能動態觀察血栓的形成情況[14-15]。肺動脈造影是診斷評估靜脈血栓栓塞癥的金標準，但由于有創且需要使用造影劑，實際應用時經常會受到限制[16]。因此，尋找一個準確、客觀的檢測指標來評估靜脈血栓栓塞癥患者疾病嚴重程度是臨床上亟待解決的問題。

本研究中發現疾病組循環細胞外DNA 水平較對照組升高，提示循環細胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞的發生有關。循環細胞外DNA 是血漿中游離的雙鏈DNA，廣泛存在于人體的血液中，可促使凝血活化、誘導血小板發生聚集，并對纖維蛋白的溶解有抑制作用[17-18]。Jiménez-Alcázar 等[19]研究發現，老年靜脈血栓栓塞患者循環細胞外DNA 水平與健康者相比明顯升高，可作為老年靜脈血栓栓塞患者死亡率的預測因子。本研究結果與之相符，證實了循環細胞外DNA 水平和靜脈血栓栓塞的形成密切相關。此外，本研究還發現靜脈血栓栓塞不同嚴重程度患者的循環細胞外DNA 水平比較，差異有統計學意義（P <0.05），中度組和重度組循環細胞外DNA 水平均高于輕度組，重度組循環細胞外DNA 水平高于中度組，且進一步進行Spearman 分析顯示循環細胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞嚴重程度呈正相關，提示循環細胞外DNA 水平可作為評估靜脈血栓栓塞嚴重程度的指標。Klopf等[20]研究發現，中性粒細胞外誘捕網可活化內皮細胞中的金屬蛋白酶，致使內皮細胞損傷，進而促進血栓的形成。中性粒細胞外誘捕網與靜脈血栓栓塞的發生存在密切的關系，其參與血栓的形成主要跟凝血因子、內皮損傷等有關，還能與血栓蛋白C 和調節蛋白結合，抑制蛋白活化參與血栓的產生[21-23]。Hashimoto等[24]在活動性疾病患者中發現中性粒細胞-血小板聚集頻率增加，可導致高濃度地循環細胞外DNA，造成血栓的形成和發展。另有研究報道[25]，血漿中DNA 含量和與血栓形成密切相關的中性粒細胞外誘捕網標志物的升高趨勢具有一致性，且具有微創性、標本獲取方便等優點。循環細胞外DNA 是中性粒細胞外誘捕網的骨架，可為血小板的黏附提供支架，并能促進纖維蛋白的沉積，加固血液凝塊，誘導血液淤滯，其水平越高則反映血液凝滯越嚴重，進而也提示了靜脈血栓栓塞也嚴重[26]。故建議臨床可通過檢測靜脈血栓栓塞癥患者循環細胞外DNA 水平來評估病情來指導臨床治療。

綜上所述，靜脈血栓栓塞患者循環細胞外DNA水平較正常人群異常升高，且與靜脈血栓栓塞嚴重程度呈正相關，隨疾病嚴重程度的增加而升高，提示循環細胞外DNA 水平可作為評估靜脈血栓栓塞嚴重程度的指標。但目前循環細胞外DNA 的確切來源還存在一些爭議，在炎癥、創傷等疾病也能檢測到循環DNA 濃度的升高，容易造成假陽性，關于循環細胞外DNA 水平在靜脈血栓栓塞癥中的臨床意義還需長期深入研究。