微小RNA在原發性膽汁性膽管炎發病機制和診療中的作用

潘仕達，蘇 楠，左焱玫，王福生，孟繁平

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis,PBC）是一種自身免疫介導的慢性炎癥性、膽汁淤積性肝臟疾病[1]，目前發病機制不明[2]。膽管上皮細胞損傷及碳酸氫鹽傘受損在PBC的發病過程中較為關鍵[3]。臨床上主要以生物化學指標升高、抗線粒體抗體陽性或肝臟組織病理學改變作為該病的診斷標準。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶基因結合干擾mRNA翻譯[4]，且其異常表達與包括腫瘤、自身免疫病及感染性疾病在內的多種疾病密切相關[5-11]。據報道，miRNA在PBC患者的肝組織和血清中有顯著變化[12-15]，通過下游因子介導膽道損傷和免疫失調。其中，miRNA可介導膽管功能障礙，抑制膽管細胞增殖，造成肝臟纖維化。此外，miRNA也可影響機體自身抗體分泌，通過抑制調節性T淋巴細胞（regulatory T cell,Treg）、誘導輔助性T淋巴細胞（T helper cell, Th）增加、促進CD4+T細胞活化、調節外泌體介導免疫反應等方式參與PBC發病機制。不同miRNA表達差異也在PBC的診斷和病情評估中發揮作用[16]。本文將綜述miRNA在PBC機制調控、診斷和治療中的研究進展，為PBC相關miRNA研究提供思路。

1 miRNA與PBC發病機制

PBC的主要發病機制為免疫細胞被過度活化而特異性攻擊小膽管細胞，導致膽管細胞功能障礙和膽道損傷。在PBC患者中有＞200個miRNA表達存在異常，miRNA與PBC患者的免疫失調和膽道損傷具有重要的聯系[12，16]。詳見表1。

表1 參與PBC發病機制的miRNAsTable 1 miRNAs involved in PBC pathogenesis

1.1 miRNA介導PBC的膽管細胞功能障礙及膽道損傷 PBC患者中不同miRNA表達差異可介導靶基因促進膽道炎癥、細胞凋亡和氧化應激[12]，如 miR-506、miR-26a、miR-34、miR-125b、miR-139-5p等。其中，miR-506是參與PBC發病最重要的miRNA之一。膽管細胞頂膜的Cl-/HCO-3陰離子交換蛋白2（anion exchanger 2, AE2）能使細胞內HCO3-進入膽道，維持膽管上皮細胞（biliary epithelial cell, BEC）的碳酸氫鹽傘，保護BEC免受有害膽汁酸影響[34-35]。而PBC患者膽管細胞中過表達的miR-506可與AE2結合，抑制其表達和轉染，損傷膽管細胞，使其分泌功能受損[16]。IL-8、IL-12和TNF-a等促炎因子可促進miR-506表達，增強細胞應激和對膽汁酸的敏感性，并誘導膽管細胞產生PBC樣特性，促進免疫激活[19]。miR-506參與III型肌醇1, 4, 5-三磷酸受體（type Ⅲ isoform of the inositol 1, 4,5-trisphosphate receptor, InsP3R3）對膽汁碳酸氫鹽分泌的調節過程[18-19，35]。InsP3R3表達下調可導致胞內Ca2+信號傳導和碳酸氫鹽分泌障礙[36]，而miR-506可特異性結合InsP3R3導致內質網Ca2+釋放減少，引發膽汁淤積[16，18]。

此外，PBC中上調的miR-26a可降低多梳家族蛋白EZH2表達，抑制Bmi1對膽管細胞的增 殖[26，37]。 上 調的 miR-34a，miR-132 可 能 導致Nrf2/Keap1軸異常，影響正常氧化應激[23]，而miR-34a還通過轉化生長因子（transforming growth factor, TGF）-β1/smad通路靶向轉化生長因子β同源誘導因子-2（transforming growth factor-beta-induced factor homeobox 2, TGIF2）促進PBC中上皮-間質轉化和肝纖維化[31]。同樣介導 TGF-β1 的 miR-125b則通過TGF-β1/TGF-β1R/血管內皮生長因子-A通路影響膽道衰老與肝纖維化[17]。高表達的 miR-139-5p通過 c-FOS/NF-κB信號通路介導TNF-α水平升高，加重PBC炎性反應[27]。然而也有研究報道稱通過JNK-FOXO3通路上調miR-34b/c可防止肝纖維化[33]。

miR-191-3p、miR-21、miR-210等 miRNAs的異常表達可影響膽汁代謝。在PBC患者中，miR-191-3p下調促進肢體表達 1樣蛋白表達，促進膽汁淤積性肝損傷，而過表達miR-191-3p可負性調控其靶基因肝受體同源物-1表達，抑制Cyp7a1和Cyp8b1表達，降低膽汁酸水平，減輕肝損傷[32]。此外，miR-21、miR-210也與壞死性凋亡和膽汁淤積有關，它們通過周期依賴性激酶2相關蛋白1或法尼酯X受體轉錄共激活因子—混合型白血病組蛋白甲基轉移酶4促進肝細胞壞死變性和膽汁淤積[21，38-40]。其中，miR-21還與PBC中的免疫細胞活化有關，參與CD8+T細胞活化，高表達的miR-21增加了細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17表達，并靶向程序性細胞死亡因子4，阻止細胞凋亡，促進 PBC 發病[20，35]。

1.2 miRNA介導PBC的免疫失調 PBC的具體發病機制尚不明，但可在病程進展中觀察到免疫耐受失調[3]。miRNA異常表達可能與促進CD4+T細胞活化、抑制Treg免疫功能、誘導Th增加、持續激活B淋巴細胞影響自身抗體分泌、調節外泌體介導抗原特異性免疫反應有關。

研究證實，miR-425、miR-181a、miR-92a、miR-155、miR-146a等可通過特定信號通路促進CD4+T細胞活化。其中，下調的miR-425通過T細胞抗原受體（T cell receptor, TCR）信號通路上調N-Ras，促進CD4+T細胞活化，誘導IL-2、IFN-γ等促炎因子過度產生[25，41]。而miR-181a可通過下調靶基因bcl-2介導促炎Th17增加和抑炎Treg減少[42]。在PBC患者中下調的miR-92a也可增加促炎Th17活化，增加IL-17表達介導組織炎癥發生[43]，然而miR-92a的下調對Treg無明顯影響[24]。上述研究表明，miR-181a和miR-92a在PBC中的下調以不同方式作用于促炎Th17，增加IL-17表達介導組織炎癥發生。而miR-155和miR-146a參與對Treg的調控。高表達的miR-155與細胞因子信號抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling, SOCS-1）和Treg標志物FoxP3表達水平呈負相關[44]，而SOCS-1可增強Treg的免疫抑制功能[45]。作為Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）的負調節因子，miR-146a可減少炎癥介質響應TLR刺激[46-47]，并靶向信號傳導轉錄激活因子1（signal transducer and activator transcription-1, Stat1）控制Treg介導IFN-γ調節[48]。在PBC患者中，miR-155和miR-146a的表達顯著增加[30]，通過負調節SOCS-1/Stat1和TLR介導免疫反應破壞機體Th1和Th2動態平衡抑制Treg免疫功能，加重PBC炎性反應。

除參與T細胞調控外，miRNA也參與B淋巴細胞激活和相關抗體分泌。Zhang等[28]觀察到在miR-223-3p、miR-21-5p下調的PBC患者中，線粒體抗丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2）特異性B淋巴細胞被持續激活，抗核抗體（gp210、sp100）水平顯著升高。miR-223-3p，miR-21-5p的潛在靶基因（TGFBR2、MEF2C、FOXP1和RBPJ）參與細胞分化、遷移、細胞凋亡、信號轉導等途徑，提示miR-223-3p，miR-21-5p可能與B細胞分化和激活、分泌及PDC-E2抗體相關[49]。

血清外泌體的miRNA可能在免疫調控中發揮作用，如miR-451a、miR-642a-3p等。miR-451a已被證明可調節樹突狀細胞（dendritic cell, DC）細胞因子[50]，miRNA-642a可調節單核細胞TLR4翻譯[51]。而PBC患者外泌體miR-451a和miR-642a-3p含量升高[29]，提示miRNA可能參與適應性免疫反應，協調抗原遞呈細胞，參與對DC的激活并上調表面標志物的表達。上述研究結果證實miRNA通過不同的信號通路參與PBC的發病，這也為PBC及膽汁淤積性肝病提供了潛在的治療靶點。

2 miRNA在PBC中的診斷和治療潛力

作為潛在的生物標志物，miRNA具有蛋白標志物無法比擬的優勢，其能夠穩定存在于循環中且與多種人類疾病密切相關。PBC患者miRNA的異常表達在診斷和評估治療效果方面可能具有價值，詳見表2。

表2 PBC潛在生物標志物的miRNATable 2 miRNA as potential biomarkers for PBC

續表2

2.1 miRNA作為輔助早期診斷和鑒別診斷的生物標志物 PBC的臨床診斷主要基于抗線粒體M2型（Anti-mitochondrial antibody subtype M2,AMA-M2）抗體、血清ALP、谷氨酰轉肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）等生物化學指標以及組織病理學的改變。研究證實miRNA可輔助PBC診斷及與其他肝病的鑒別。

最早的研究報道稱，在PBC患者肝組織中miR-122a，miR-26表達下調，而miR-328，miR-299-5p表達上調[12]。在PBC外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中也發現了miRNA的表達異常，miR-15a-5p、miR-20a-5p、miR-140-3p、miR-106b-5p表達升高，而miR-3645、miR-181a-5p表達降低[13]。另有報道稱在PBMCs中miR-155，miR-146a表達也顯著增加[30]。最近研究報告了一組miRNA組合（miR-122-5p、miR-141-3p及 miR-26b-5p） 對 PBC 具有較高診斷準確性（AUC為0.905，95% CI：0.857～0.953，敏感度80.5%，特異度88.3%），該miRNA組合的診斷準確度高于ALP（AUC為0.537，95% CI：0.195～ 0.434，P ＜ 0.001）、抗核抗體（antinuclear antibody, ANA）（AUC為0.739，95% CI：0.012 ～ 0.213，P=0.0282），但低于AMA-M2抗體（AUC為0.982，95% CI：0.0618～0.198，P=0.0002）。對PBC不同臨床階段（臨床前、無癥狀、有癥狀和肝功能不全）患者分析后（AUC分別為0.835、0.879、0.867和0.901）得出，該組合診斷性能與疾病狀態無關[53]。

在鑒別方面，下調的miR-505-3p，miR-139-5p，miR-197-3p可能作為PBC患者臨床診斷和與病毒性肝炎鑒別診斷的重要標記分子[54]，而miR-26a，miR-299-5p，miR-328，miR-let-7a在 PBC患者中的上調可能在鑒別自身免疫性肝炎與PBC中發揮重要作用[30]。在另一項研究中，AMA-M2陰性PBC患者血清miR-21，miR-150水平明顯高于健康對照及AMA-M2陽性PBC患者，且與AMA-M2抗體滴度呈負相關（miR-21：r=0.4，P=0.001； miR-150：r=0.3，P=0.016）；相比于肝硬化或肝纖維化患者，非肝硬化PBC患者miR-21表達顯著增加（P＜0.05）[55]。該結果也為AMA-M2陰性且無明顯肝硬化的早期PBC診斷提供潛在檢測指標。除miR-21外，miR-214在患有嚴重肝纖維化（F3～F4）膽道閉鎖患者肝組織中表達顯著上調，ROC分析顯示，預測嚴重肝纖維化miR-214截點水平為0.805（P=0.0046）[56]。因此，miR-21，miR-214可能作為肝纖維化的非侵入性預測因子。

2.2 miRNA早期分期評估輔助預測PBC疾病進展 在PBC不同分期和亞型中，miRNA存在表達差異。研究顯示，19個miRNAs在緩慢進展型PBC患者與肝功能衰竭和門靜脈高壓患者之間存在表達差異，而晚期PBC患者血清中miR-139-5p的表達明顯低于早期PBC患者和健康對照，這也提示其在預測疾病進展方面具有潛在價值[27]。另一項研究報道了中重度膽管炎（2～3級）PBC患者的miR-299-5p表達水平顯著高于輕度膽管炎（0～1級）[57]。相比之下，活動性肝炎的嚴重程度與miR-299-5p表達水平無相關性[30]。與上述研究結果相似的是，miR-223-3p和miR-21-5p從PBC I期到III期顯示出一致的下調和表達抑制[49]。而在T細胞中，miR-let-7b的表達水平與Mayo風險評分、IL-18、ALP水平呈負相關，并隨著PBC嚴重程度的增加而表達降低（I＞II/III＞IV期）[52]。上述miRNAs有可能成為預測疾病進展的關鍵生物標志物。

2.3 miRNA在PBC中作為療效評價靶點的潛力 熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）是治療PBC的一線藥物，但仍有40%的PBC患者應用UDCA治療效果不佳。目前采用的療效評價存在耗時較長，檢測指標多等問題。在研究難治性PBC相關miRNA時發現，血清DBIL、AST、ALT、GGT水平升高與miR-122、miR-378f表達上調有關，miR-4311表達降低與AST和ALT水平下降有關，miR-4714-3p水平與TBIL、LDH水平呈負相關。研究者指出miR-125b，miR-let-7b，miR-520a-5p等miRNAs可能成為難治性PBC的潛在生物標志物[15]。研究顯示，對UDCA耐藥的PBC患者PBMC中的miR-299-5p的表達增加，miR-299-5p表達與ALP、GGT和IgM水平正相關[30]，提示通過miR-299-5p靶向蛋白與PBC的疾病活動和狀況相關。另一項研究也表明UDCA的治療反應與膽管減少癥的關系更密切[58]。上述研究初步地對耐藥PBC患者與健康人的miRNA表達差異進行討論，后續仍需要在耐藥組和敏感組PBC患者中進行進一步的對比和驗證，同時注意UDCA治療對PBC患者miRNA表達水平變化的影響。

2.4 基于miRNA作為靶點治療PBC的進展 在dnTGF-βRII小鼠中，研究者利用依諾沙星上調miR-346-5p、miR-326-3p、miR-181a、miR-145a-5p等miRNAs的表達，從而下調關鍵效應T細胞轉錄因子的表達，來介導IFN-γ和穿孔素的CD8+T細胞效應功能下調，有效地阻止自身免疫性膽道疾病的進展[59]。部分miRNA抑制劑（反義寡核苷酸）和miRNA類似物如miR-375抑制劑、antagomiR-155和miR-24類似物等已應用于某些疾病的治療。但目前僅有miR-125a納米顆粒和miR-103-3p外泌體在系統性紅斑狼瘡和誘導肝星狀細胞活化中應用的報道[60-61]。miRNA在體內不能保持有效抑制所需的高劑量，使得miRNA靶向藥物在臨床應用中受到限制[62]，病毒介導的miRNA轉染相關免疫反應的不良反應也未得到有效解決。

3 總結及展望

miRNA在PBC發病及進展的過程中具有關鍵作用，其機制研究將有利于探索PBC新的治療靶點，且特定miRNA組合可能在臨床實踐中具有診斷價值。雖然miRNA在PBC療效預測方面的作用也已被初步證實，但受限于樣本量及標準治療的影響，后續需要來自多個中心的更多人群以及接受治療前后的對比差異研究，來評估miRNA與治療反應以及預后預測的臨床結果之間的相關性。miRNA作為無創生物標志物展現出獨特優勢，是早期病情評估的重要補充。而探究在PBC發病過程中參與的miRNA可提供潛在的治療靶點選擇，為PBC提供新的診療策略思路。