二重實時熒光RT-PCR 檢測法在口蹄疫病毒檢測中的應用

王凱

（東營市河口區動物疫病防治監控中心，山東東營 257200）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物的一種強傳染性疾病。快捷、精準、可靠的診斷對防治FMD 具有很大的現實意義，配合應用有效的手段，實驗室一定要在24h 內得出相應結論。既往報道稱，動物與肉類產品攜帶病毒是導致FMD 屢次發生的主要原因。病毒分離、血清學試驗等常規診斷方法不僅耗時耗力，且特異性不強，很難滿足疫病病毒快速、精準診斷的實際需求。雖然RT-PCR、競爭PCR 方法彌補了以上缺點，可以診斷FMD，但存在時間長、成本高、易被污染及各次檢測樣本數目少等不足。近些年發展的二重實時熒光RT-PCR 結合了PCR 與熒光檢測的優勢[1]，為實現對試樣內FMDV 的精準定性與定量檢測，適應病毒核酸快速檢測的全新思路，本研究探究二重實時熒光RT-PCR 在FMDV 檢測中的應用情況。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料與試劑

FMDV 標準株（O、A 與Asia Ⅰ型），經滅火處理的豬水泡病病毒（SVDV）、水泡性口炎病毒（VSV）、環病毒2 型（PCV2）等7 種疫病病毒，動物疫病防控中心提供臨床試樣并規范保存SVDV、VSV 等陽性試樣。

儀器有核酸提取儀、熒光定量PCR 儀，試劑盒有質粒DNA 純化試劑盒、FMD、熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 設計與合成引物

對比分析后選擇FMDVO、A、Asia Ⅰ3 種不同血清型的3C 基因與FMDV-A 型VP1 基因序列作為模板，設計出通用型（FMDV-T）與A 型（FMDV-A）兩種引物（分別是5' -CGAGTCCTGCCACGGAGAT-3'、5' -CTGTGATGGCYT CGAAAAGA-3'）及TaqManTMMGB 探針，即-5'（FAM）-ATGGTCCACGGCGTGCAA-(TAMRA) -3'。

1.2.2 制作模板

應用核酸提取儀，嚴格按照試劑盒說明書要求逐一提取O/A/Asia ⅠFMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PEDV 總RNA和PCV2、PRV、PPV 總DNA。把RNA 反轉錄成cDNA，cDNA 與總DNA 用在PCR 擴增過程，或低溫（-20℃）環境下凍存備用。

1.2.3 制備FMDV-T/FMDV-A 標準品

具體是將相應的陽性擴增產物依次克隆至pGEM-TEasy 載體里，從中篩選出陽性重組質粒，T7 與SP6 引物檢測其序列。針對測序準確的陽性質粒，光度計檢測OD260與OD280，測算兩者的比值，重復進行5 次。參照既往發表文獻內提及的方法測算出濃度，pGEM-T/FMDV-T 與pGEM-T/FMDV-A 質粒DNA 濃度依次為9.13×1010、9.12×1010拷貝/μL，定量處理并稀釋到1.0×100～1.0×1010拷貝/μL，于低溫環境下保存備用。

1.2.4 完善二重FQ-PCR 反應條件

分別把pGEM-T/FMDV-T 與pGEM-T/FMDV-A 稀釋到1.0×105拷貝/μL，并將其作為檢測模板。引物對P1/P2、P3/P4 及探針Probe-P5、Probe-P6 稀釋的最后濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 與1.0μmol/L。在PCR儀的協助下，用矩陣法篩選出濃度有差異的引物和探針組合，有針對性的優化反應溫度、時間等參數，其目的是獲得最小Ct值與偏高的熒光強度。

1.2.5 FQ-PCR 特異性試驗

量取適量O/A/Asia ⅠFMDV 及SVDV 等7 種不同的疫病病毒，把pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-A 混合物作為陽性對照，細胞培養作為陰性對照液，按照前期完善后的FQ-PCR 反應條件執行FQ-PCR 擴增過程，通過這種方式檢測驗證這種方法的特異型號。

1.2.6 穩定性與重復性試驗

基于前期優化好的FQ-PCR 反應條件，依次對4 個不同濃度的10 倍系稀釋后的pGEM-T/FMDV-T 與pGEM-T/FMDV-A 進行擴增處理，各系列均設計3 個重復，通過以上過程檢驗這種方法的穩定性與重復性。

1.2.7 二重FQ-PCR 的臨床試驗

結合FMDV-T/FMDV-A 二重FQ-PCR 等建立情況，調配出檢測試劑，陰、陽性對照分別選用細胞培養液、FMDVT/FMDV-A 陽性質粒混合物，針對124 份疑似FMDV 感染試樣進行檢測，統計檢出情況。

2 統計和分析結果

2.1 FQ-PCR 反應條件的完善

通用型與A 型各個引物與探針應用如下濃度取得的擴增成效最優：反轉錄引物于37℃條件下持續反轉錄1h；P1、P3、P5、P6 濃度統一是200nmol/L，P2、P4 濃度為400nmol/L。完善后的反應程序：94℃65min，94℃30s，60℃45s，重復運行40 個循環。陰性對照的檢測結果應沒有特定擴增曲線，且Ct＞30 或無，陽性對照內Ct≤27，且會形成特定的擴增曲線，據此可以斷定檢測結果成立。

2.2 特異性

優化反應條件后創建了二重熒光RT-PCR，分別檢測FMDVO、A、AsiaⅠ型，通用型FAM、A 型VIC 均通道陽性[2]，檢測以7SVDV 為代表的其他7 種不同的疫病病毒株結果均呈陰性反應。綜合分析可以初步認定，本課題研究中設計出的引物探針僅對目標病毒表現出特異性，和其他檢測對象沒有發生交叉反應（圖1）。

圖1 二重FQ-PCR 方法的特異性試驗

2.3 穩定性與重復性

觀察比較1.0×105、1.0×104、1.0×103拷貝/μL 不同濃度下FMDV-T/FMDV-A 混合物重復的試驗結果發現，其均呈陽性，而1.0×100拷貝/μL 下質粒等量混合物的試驗結果均顯陰性（表1），提示建立的二重FQ-PCR 方法的穩定性與重復性均處于較高水平。

表1 FQ-PCR 方法的重復性試驗結果統計

2.4 臨床試驗

應用本課題研究構建的MDV-T/FMDV-A 二重FQ-PCR檢測方法檢測124 份疑似FMD 試樣，結果顯示FMDV-T 陽性10 份，FMDV-T/FMDV-A 雙陽性7 份，其他均呈陰性。RT-PCR 檢 測 統計 發 現，FMDV-T 呈陽 性、FMDV-T/FMDV-A 雙陽性分別有9 份、6 份。而熒光定量RT-PCR 試劑盒檢出FMDV-T 陽性11 份，FMDV-T/FMDV-A 雙陽性6份。經比較認定，本文構建的二重FQ-PCR 方法的靈敏性高于RT-PCR 法，提示其能取得較好的臨床應用效果。

3 討論

FMDV 是小RNA 病毒，基因組大概8.5kb，共計有7 各血清型[3]，既往國內外均有試驗表明，不同血清型FMDV 之間不會發生交互免疫反應，故而實現快速、精準檢測是研究及防治FMD 的關鍵內容之一。常規RT-PCR 方法能對7 個血清型病毒進行通用檢測，并對其類型做出特異性針對，較好彌補了血清學診斷、實驗室檢查方法應用中暴露的不足。但RT-PCR方法的敏感性不足，很難完全取代日常診斷檢查方法。最新構建的PCR-ELISA 方法盡管有助于提升MDV 定性與定型診斷的敏感度，但在檢測大量試樣時被污染的概率較高。

鑒于以上實際情況，本課題在同個反應管中開展了FMDV通用型與A 型擴增檢測活動，并采集了相應的熒光信號，實時在線檢測了形成的擴增產物，進而構建了二重鑒別實時熒光RT-PCR 法。通過試驗研究證實這是一種簡單、快捷、運行有效的檢測平臺。O 型與A 型FMD 是當前我國FMDV 主要分型，早在數年前，國家相關部門就推出了AsiaⅠ型FMD 的強制免疫規定，故而，FMDV 病原鑒別診斷的對象以O 型與A型為主。

4 結論

本文建立的檢測方法能同時執行FMDV 不同亞型的鑒別檢測任務。既往有研究指出，在臨床病毒混合感染早期，多數病毒以潛伏感染形式存在，即病毒含量很低。二重Q-PCR 法檢測FMDV-T 與FMDV-A 的最低檢出限達到1.0×100拷貝/μL，預示著其能實現精準區分。統計本文試驗結果發現，pGEMT/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-A 重組質粒均呈現出陽性擴增信號，共計檢測出FMDV-T 陽性10 份，FMDV-T/FMDVA 雙陽性7 份且和基因測序結果相一致，驗證了方法的有效性，值得推廣。