膠體金標記兔抗-維氏氣單胞菌Lam B 多克隆抗體的制備與優化

黃凌遠 鄢林霞 徐婧 俞雨陽 熊權鑫 鐘振東

（成都里來科創生物科技有限公司，四川成都 610000）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）隸屬于弧菌科，氣單胞菌屬，是一類革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌，是一種人、獸及水生動物共患的條件致病菌，常引起水生動物腐皮病、爛尾病、細菌性敗血癥等多種病癥，具有發病快、死亡率高的特點，給水產養殖造成巨大的經濟損失[1-2]。斑點叉尾鮰作為人工養殖魚種，具有生長繁殖快，魚肉品質鮮等優點，但由于養殖條件等原因，感染維氏氣單胞菌發病死亡的案例逐漸增多[3]。目前常采用平板分離培養法和分子生物學的方法進行檢測。但上述兩種方法均存在檢測時間過長、檢測效率低下、對專業檢測人員和檢測儀器要求高等缺點，不利于在基層推廣。因此，開發一種靈敏高、檢測速度快、操作簡便的維氏氣單胞菌檢測產品十分必要。

外膜蛋白（OMP）是革蘭氏陰性菌外膜中的主要結構成分，也是維氏氣單胞菌重要的黏附因子。該類蛋白不僅能增強病原菌黏附能力，還具有良好的免疫原性，在魚類疫苗研究中經常作為候選蛋白[4]。Lam B 蛋白屬于革蘭氏陰性菌的外膜孔蛋白家族，即Maltoporin 蛋白，是由lamB 基因編碼，其功能如同特定麥糖糊精和麥芽糖通過大腸桿菌外膜的通道，能特異性攝取小分子物質，參與麥芽糖的攝取，具有較好的免疫原性，可作為亞單位疫苗的候選抗原[5]。Yang 等報道了Lam B 蛋白對維氏氣單胞菌TH0426 的毒力和粘附能力具有增強作用[6]。

膠體金一般指以氯金酸為原料，在還原劑的作用下形成的一種膠體顆粒，可以與蛋白質特異性結合，保留蛋白質生物學特性，是膠體金免疫層析檢測技術的基礎[7]。本研究擬采用檸檬酸三鈉法制備膠體金，該方法成本低，操作快捷、方便，結果準確，已經用于臨床與科研等領域[8]。本實驗通過制備膠體金對原核表達的Lam B 蛋白制備的兔抗-Lam B 多克隆抗體進行膠體金標記，優化膠體金制備條件和金標耦聯條件，以期制備高質量的膠體金-兔抗-Lam B 多克隆抗體，為后續開發維氏氣單胞菌的膠體金檢測試紙奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔抗-Lam B 多克隆抗體（成都里來科創生物實驗室自制）；氯化金四水合物、檸檬酸三鈉、碳酸鉀均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 主要儀器

1530 酶標儀 [賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、FA2004N 電子天平（上海菁海儀器有限公司）、Direct-Q 3 超純水系統（德國默克密理博公司）、85-2A 磁力攪拌器（金壇市友聯儀器研究所）等。

1.3 膠體金制備前處理

實驗中使用的各種玻璃器具均應先用洗滌劑清洗，自來水洗凈后置于酸性重鉻酸鉀溶液（100g 重鉻酸鉀，加入750mL 蒸餾水，250mL 濃硫酸）中浸泡。12h 后取出用蒸餾水沖洗3 次，接著用雙蒸水沖洗3 次，用錫紙包住瓶口放進烘箱，烘干備用。

1.4 檸檬酸三鈉最佳加入量的優化

取4 支干凈的試管分為1～4 組，分別加入1%檸檬酸三鈉（75、100、150、200μL）與0.01%氯化金四水合物10mL，作為試驗組。另取1 支干凈試管不加檸檬酸三鈉，僅加入10mL 0.01%的氯化金四水合物作為空白對照組。試驗組和對照組均加入超純水補齊至相同反應體積（10.2mL）。加熱前，5 支試管混合液分別使用0.22μm 濾膜過濾至新的試管中，水浴加熱至沸騰，觀察試管中溶液顏色變化，待顏色保持不變后，繼續加熱10min，室溫靜置冷卻，評價膠體金質量。評價標準：①肉眼觀察膠體金穩定后的顏色；②使用酶標儀在可見光范圍內（400～700nm）對4 組試驗組膠體金進行波長掃描，獲得膠體金可見光吸光譜，確定最大吸收波長。根據公式：y=0.4271x+514.56 計算膠體金粒徑[9]。式中，y 為最大吸收波長（nm），x為膠體金粒徑（nm），結合波長、粒徑篩選出最佳檸檬酸三鈉的加入量。

1.5 兔抗-Lam B 多克隆抗體的抗體標記濃度和pH 優化

在96 孔酶標板中分別加入200μL 膠體金，然后加入0.2mol/L K2CO3 調節pH 分別至6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，對應體積分別為4.5、7.5、8、10、16、19、23.5μL，隨后加入濃度為1μg/μL 兔抗-LamB 多克隆抗體，加入體積分別為2、3、4、5、6、7μL，混勻，5min 后加入10% NaCl 溶液20μL，室溫靜置20min。使用酶標儀在520nm 讀取吸光度，吸光度最大的孔即為最佳pH 和最佳抗體濃度組合。測量未標記膠體金和最佳抗體標記條件下的金標-兔抗-Lam B 多克隆抗體在400～700nm 的吸光譜，分析比較膠體金粒徑分布。

2 結果

2.1 檸檬酸三鈉最佳加入量

檸檬酸三鈉與氯金酸的結合比例決定了膠體金的粒徑，粒徑大小會影響抗體與膠體金的結合程度，粒徑過小時，膠體金顏色呈橙黃色，粒徑過大時，顏色呈暗紅色甚至黑色，當膠體金粒徑為20nm 左右，最大吸收波長處于510～540nm 時，與抗體結合的效果最好，此時膠體金會呈現出酒紅色[10]，本實驗將10mL 0.01%氯化金四水合物加入1%檸檬酸三鈉后，在加熱過程中的液體顏色變化逐漸變成淺黃色、灰色、紫紅色/酒紅色，而未加入1%檸檬酸三鈉的空白對照組顏色無變化。使用400～700nm 波長掃描各體系發現，組別3 試管中膠體金的顏色呈酒紅色，最大吸收波長為524nm，吸光度值為0.6273（圖1），換算膠體金粒徑為22.10nm，最符合制備抗體膠體金的條件（表1），因此，后續試驗選擇10mL 膠體金加入體積為150μL 的1%檸檬酸三鈉比例制備膠體金。

表1 檸檬酸三鈉加入體積優化

圖1 4 組檸檬酸三鈉加入量制備的膠體金可見光掃描圖譜

2.2 膠體金與兔抗-兔抗-Lam B 多克隆抗體結合的最佳濃度與pH

加入兔抗-Lam B 抗體的濃度為7μg，pH 為8.5 時，膠體金-兔抗-Lam B 在524nm 處的吸光度最大值為0.6439，與未標記膠體金最大吸光度（0.6493）相比無明顯差異；比較分析兩者在400～700nm 的吸收光譜后發現，兩者波形、峰寬與峰高無明顯變化（圖2）。

圖2 未標記膠體金與膠體金-兔抗-LamB 的可見光掃描圖譜

3 結論與討論

膠體金標記的抗體在食品、藥品、臨床檢測上均得到廣泛運用，由于膠體金標記顆粒屬于納米級技術，是決定膠體金結果的關鍵，因此，在制備過程中優化制備條件十分重要。本研究發現，在10mL 0.01%氯金酸中加入150μL 1%檸檬酸三鈉制備而成的膠體金在524nm 處具有最大吸收峰，波峰窄，呈酒紅色，粒徑符合抗體膠體金的要求。

圖3 不同兔抗-Lam B 抗體濃度與體系中pH 值對膠體金-兔抗-Lam B 吸光度的影響（524nm）

當膠體金中加入目的抗體后，膠體金對抗體蛋白具有吸附作用，此時抗體濃度與pH 會對膠體金吸附效果產生影響。當pH 低于蛋白質等電點時，抗體會形成聚合體，失去與膠體金的結合能力，此時需要加入K2CO3等堿性試劑調節pH[11]。本試驗的目的抗體是兔抗-Lam B 抗體，優化發現抗體與膠體金最佳結合pH 為8.5，抗體濃度為7μg/μL，此時抗體膠體金在400～700nm 的波形未發生明顯變化，峰寬與最大吸收波長未出現明顯偏移，在524nm 處的吸光度與未標記膠體金無明顯差異，說明膠體金粒徑接近未標記的膠體金，標記前后變化不明顯。

綜上所述，本研究發現膠體金標記兔抗-維氏氣單胞菌Lam B 多克隆抗體制備中檸檬酸三鈉與氯化金四水合物的最佳比例為150μL:10mL，兔抗-Lam B 多克隆抗體的最佳濃度為7μg/μL，反應體系最佳pH 為8.5。