低度檸檬酒在發酵過程中的品質變化

楊艷麗，楊宇航，王璐瑤，索化夷，王洪偉，張玉*

1(西南大學 食品科學學院, 重慶, 400700)2(西南大學 食品科學與工程國家實驗教學示范中心，重慶, 400700)

檸檬 (Citruslimon)年產量約占世界柑橘總產量的9%，其富含檸檬酸、類黃酮、維生素C、維生素A、維生素E以及Ca、Fe、Zn等多種礦物質及微量元素，具有清除自由基、降低膽固醇、預防壞血病等功效[1]。目前，僅有20%的檸檬被加工，加工產品主要為檸檬干片，雖然市場上也有少量的檸檬果酒，但是這部分檸檬酒以調配酒為主，發酵型較為罕見。此外我國的酒類市場規模已達億萬級別，盡管低度酒所占市場份額較小，但是近幾年其呈現良好的發展趨勢，品類不斷增長[2]。而相較于白酒、啤酒等傳統酒類，檸檬酒逐漸成為酒水消費主力軍的年輕人更愿意消費可自主掌控飲酒體驗、口味豐富甘甜的低度酒。因此生產出品質較好的發酵型低度檸檬酒既可以為檸檬的深加工提供途徑，同時也能夠滿足市場需求。

目前國內外有關檸檬酒的研究較少，且主要集中在發酵工藝優化、發酵菌種篩選、脫苦技術及澄清工藝探索等方面。何雪梅等[3]發現發酵青檸檬酒的最佳工藝為添加0.25%的安琪RW酵母、可溶性固形物含量25%、pH 2.9，制得的成品酒酒精度為13.2%vol。梅明鑫等[4]建立了柚皮苷和檸檬苦素脫除率的二元回歸方程，并確定了適宜的脫苦處理方法為添加0.55 g/100 mL β-環糊精于42 ℃下處理77 min。

盡管酵母可以在發酵階段為果酒產生大量的乙醇，但此時酒體并不成熟，口感也較為粗糙和酸澀，而在陳釀期間，果酒通過縮合、氧化還原等反應，其酒體會變得更加飽和[5]。所以，明確最佳陳釀時間既可以更好地把控發酵型低度檸檬酒的品質，也能夠更好地協調果酒的生產，節約人力物力，減少生產成本。而目前關于果酒陳釀過程中的品質變化的研究主要針對于葡萄酒，還未見針對檸檬酒陳釀品質的研究。本文對不同發酵和陳釀階段檸檬酒的揮發性成分、理化性質、感官品質進行了測定和分析，探究發酵和陳釀過程中檸檬酒的品質變化以及檸檬酒的最佳陳釀時間，以期為檸檬酒的生產和加工提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尤力克檸檬、白糖，重慶永輝超市；NaOH、酚酞指示劑，重慶市鈦新化工有限公司；2-辛醇(GC標準品)，重慶市金喜鵲科技公司；安琪果酒酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LHS-50SC恒溫恒濕培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；CM-5分光式色差儀，日本柯尼卡美能達控股公司；WZS-32手持式糖度計，上海儀電物理光學儀器有限公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；手動進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀造工藝流程

挑選→去籽→榨汁→成分調整→滅菌→接種→發酵→原酒→陳釀

操作要點：挑選大小均勻的檸檬，加入3倍質量的純凈水榨汁,使用紗布過濾殘渣，使用白砂糖調整糖含量為20%(質量分數，下同)，70 ℃下加熱5 min殺菌，冷卻到30 ℃以下時，接種0.12%(體積分數)活化后的酵母菌，置于32 ℃的培養箱中發酵10 d，發酵完成后轉入到陳釀罐中于4 ℃下避光陳釀樣品分組為：檸檬汁(f-0)、發酵10 d(f-10)、陳釀7 d(a-7)、陳釀14 d(a-14)、陳釀28 d(a-28)、陳釀42 d(a-42)。

1.3.2 檸檬酒理化指標的測定

可溶性固形物(折光計法)、滴定酸 (氫氧化鈉滴定法, 以檸檬酸計)、酒精度(酒精計法)、pH值 (pH計測定) 的測定方法參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 色澤

檸檬酒的色澤是其品質的重要指標，取50 mL檸檬酒用色差儀在透射模式避光條件下測定色澤，用L、a和b表示。

1.3.4 GC-MS分析

參照鄭淑丹等[6]的方法并略作修改。

取4 mL稀釋8倍后的檸檬酒加入到15 mL樣品瓶中，并加入60 μL的2-辛醇(32 g/L)內標物、1 g NaCl和磁力攪拌子，50 ℃下頂空萃取20 min。萃取后將萃取頭插入GC進樣口，解吸5 min。

GC條件：色譜柱DB-5MS (30 m×0.25 mm, 0.25 mm)；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后8 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；He流量1.0 mL/min；無分流進樣；進樣口溫度：250 ℃。MS條件：電子電離源；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；掃描速率全程35～450m/z。

定性定量分析：GC-MS實驗數據由NIST18.0數據庫的相似度檢索進行定性。以2-辛醇為內標半定量，各化合物濃度按照公式(1)計算：

(1)

1.4 感官分析

使用Flash Profile(FP)法進行檸檬酒感官評價，具體操作參照文獻[7]。從本校中招募12名未參加過感官分析培訓的本科生(5男7女)作為本次實驗的感官評定小組。實驗開始前向感官評定小組成員介紹FP法和實驗流程。由12名感官評價人員對6個發酵階段的檸檬酒進行感官評價，從外觀、香氣、風味、余味等各方面盡可能多地產生描述樣品間差異的不代表情感的感官描述詞，經匯總討論形成檸檬酒感官描述詞表，每位評價人員從該表單中選取自己能感知到差異的描述詞，根據所選描述詞在評價表上對樣品進行強度排序。評價表上有多條15 cm長的線段，每條線段從左到右表示感官性質由弱到強。感官實驗完成后，收集所有表單測量每一感官詞下每一樣品對應的線段長度，即為該樣品該感官屬性的強弱。

1.5 數據分析處理

2 結果與分析

2.1 檸檬酒在發酵過程中品質指標的變化

由表1可知，隨著發酵和陳釀的進行，檸檬酒的可溶性固形物含量和pH值逐漸降低，分別由f-0的20.17%和2.72下降至a-42的11.53%和2.19。總酸含量逐漸增加，a-14，a-28，a-42的總酸含量(9.24、9.20、9.35 g/L)無顯著性差異(P>0.05)。酒精度先增加后降低，a-28時達到峰值4.93%vol，a-42和a-48的酒精度并無明顯差異(P>0.05)。

表1 不同發酵階段的檸檬酒的理化特性Table 1 Physicochemical characteristics of lemon wine in different fermentation stages

發酵開始時提供了充足的糖類物質和適宜的發酵溫度，以酵母為主的微生物生長繁殖活動旺盛，不斷將糖類物質轉化為乙醇、酚類、芳香族氨基酸以及多種酸類物質[8]，故在發酵和陳釀過程中酒精度和總酸含量增加。而當乙醇的濃度達到一定量時，酵母的生命活動便會被抑制，從而導致酸類物質和乙醇的生成速率減慢。此外，后3個階段的總酸含量無顯著性差異(P>0.05)，也有可能是有機酸與氨基酸相互緩沖導致[9]。pH會影響酵母的生長和最終產品的特性[10]，是果酒發酵的一個關鍵因素，而酸類物質的積累一定程度上降低了檸檬酒的pH。

使用L值、a值、b值、彩度值C和總色差ΔE來衡量陳釀和發酵過程中的檸檬酒的顏色變化。如圖1所示，除f-0的a值(-0.61)為負值外，其余檸檬酒的a值為正且差異顯著(P<0.05)。a-42最接近紅色。ATANASOVA等[11]提出紅酒中花青素和單寧酸的轉化會導致紅色加深。另外，f-0的b值最小(25.51)，a-42的b值最大(30.17)，可能是檸檬酒在發酵和陳釀過程中產生了黃色的物質。ES-SAFI等[12]的研究表明在發酵過程中由酚類化合物氧化形成的醌類化合物，在聚合之后會形成黃棕色色素，此外酚類物質氧化后產生的H2O2可將乙醇氧化為乙醛，乙醛在酒石酸氧化產生的二聚體的作用下進一步形成棕色物質。C值越大說明該物體顏色飽和度越高，反之則越低。f-0的色彩飽和度最低，a-42的色彩飽和度最高(5.61)。總色差ΔE能夠準確地反映物體表觀色彩的準確性，5個發酵階段檸檬酒的顏色與檸檬汁顏色的色差均在25以上，肉眼可以辨別兩者的顏色差別。

圖1 不同發酵階段檸檬酒色澤Fig.1 Color of lemon wine in different fermentation stages注：不同小寫字母表差異顯著(P<0.05)

2.2 不同發酵階段檸檬酒的揮發性成分

在檸檬汁和5個時期的檸檬酒中共檢出109種揮發性成分，包括酯類15種、醇類25種、萜烯類36種、酸類5種、醛酮類14種和其他14種(表2)。不同發酵階段的檸檬酒的揮發性成分種類和含量不同。f-0、f-10、a-7、a-14、a-28、a-42中依次檢測到56、50、47、47、59、55種化合物，揮發性成分的物質含量依次為350.55、127.58、110.48、121.76、135.27、160.80 mg/L，從a-14到a-42，揮發性成分的含量和數量均呈現增長趨勢。

酯類是果酒的特征性成分，其在檸檬酒中的含量雖然不多，但是能夠賦予果酒柔和的口感和持久的香氣。f-10中僅檢測到4種酯類，占比1.8%，分別是乙酸橙花酯(2.62 mg/L)、乙酸香葉酯(2.16 mg/L)、硬脂酸甲酯(0.39 mg/L)和棕櫚酸甲酯(1.13 mg/L)，其中乙酸香葉酯和乙酸橙花酯在所有階段中都有檢出，是檸檬酒的共有物質。乙酸橙花酯呈現橙花、玫瑰花的香味，乙酸香葉酯具有柑橘香。f-10、a-7、a-14、a-28、a-42的酯類揮發性成分含量依次為16.24、15.81、20.79、9.91、10.47 mg/L，呈現先升高后降低的趨勢，可能是醇類和酸類在釀酒酵母相關酶的作用下被轉化為酯，而進行到陳釀后期，酯類化合物被微生物或相關酶分解[13]。癸酸乙酯、壬酸乙酯、香葉酸甲酯、辛酸乙酯、乙酸松油酯、乙酸香茅酯、月桂酸乙酯在5個時期的檸檬酒中均被檢測到。癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸橙花酯的含量在a-28明顯降低，可能是發生了水解反應。

醇類是果酒發酵成功與否的重要檢測指標，糖類分解代謝以及氨基酸脫羧、脫氨后均會產生醇[14]。陳釀階段，檸檬酒的醇類物質不斷積累，a-42達到96.44 mg/L，在所有階段的檸檬酒中最高。f-0中的醇類含量相對較高，達到了80 mg/L，而f-10中顯著降低，僅有39.1 mg/L，這與曾竟藍[5]的研究結果一致，可能是在發酵階段產香酵母利用醇類物質生成了酯[15]。少量的高級醇便能夠使果酒產生優雅的香氣[16]。異戊醇、芳樟醇、橙花醇、α-松油醇、D-香茅醇等高級醇的含量在陳釀時不斷增加，因為氨基酸通過Ehrlich途徑被轉氨為氨基酸α-酮酸，然后脫羧成醛，最后通過還原反應變成高級醇[17]。而當高級醇的濃度高于400 mg/L時，其他揮發性化合物香氣會被抑制，并產生令人不快的風味[18]。(-)-4-萜品醇、α-松油醇、芳樟醇、異香葉醇是含量最多的高級醇類物質，是檸檬果酒的特征風味化合物，在釀造過程中均先降低后升高，但是異香葉醇在f-0中含量為34.7 mg/L，而發酵后含量均低于0.15 mg/L，可能是在發酵的過程中被轉化為其他物質。α-松油醇、橙花醇、芳樟醇、香茅醇、β-松油醇、葑醇在所有階段中均有檢出。其中芳樟醇對柑橘類鮮果和果汁風味的形成起著重要作用，是優質果皮油和橙汁中最重要的成分之一[19]。

萜烯類物質是檸檬的主要揮發性成分，賦予了檸檬獨特的香氣。在f-0中共檢出了21種萜烯類化合物，含量為181.28 mg/L，相對含量為51.71%，其中檸檬烯、β-蒎烯、萜品烯、β-月桂烯為f-0的主要萜烯類化合物。f-0中檸檬烯的含量高達99.36 mg/L，但在其余階段中未被檢出，可能是在發酵過程中被轉化為D-檸檬烯。f-10、a-7、a-14、a-28、a-42中萜烯類化合物的含量依次為56.31、58.67、58.12、49.78、51.67 mg/L，相比f-0，發酵檸檬酒的萜烯類化合物減少很多，主要是因為不飽和烯烴在釀造過程中氧化分解，轉化為醇類、酸類、醛酮類等對果酒品質有重要貢獻的風味物質[5]。D-檸檬烯、β-蒎烯、α-蒎烯、石竹烯、萜品烯、β-月桂烯、β-紅沒藥烯是發酵檸檬酒的主要萜烯化合物，其中D-檸檬烯是各發酵檸檬酒中含量最高的的萜烯類化合物，但是RODRGUEZ等[20]發現D-檸檬烯對甜橙氣味的形成貢獻不大，并認為其可能通過在復合香氣混合物中作為其他化合物的溶劑與其他甜橙氣味成分協同作用。

來源于原料本身以及釀造過程中產生的醛類和酮類物質對果酒的獨特香氣的形成起著至關重要的作用。但是在發酵檸檬酒中僅有少量的醛酮類化合物被檢測到，而在f-0中則檢測到12種醛酮類化合物，含量為76.91 mg/L，其中(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、檸檬醛、壬醛、癸醛為檸檬汁的主要醛類化合物。酸類物質不僅能夠賦予果酒清冽的口感，同時在酯類物質的形成過程中也起著重要的作用，果酒中的酸類物質主要來源于釀酒酵母的代謝活動和醇類物質的氧化。但本次僅檢測到5種揮發性酸類，分別是辛酸、癸酸、乙酸、紫蘇乙酸和2-羥基肉豆蔻酸，且各種酸類化合物的含量均較低，辛酸在所有發酵階段中均被檢測到。共檢測到14種其他類化合物，其含量隨發酵時間的延長先升高后降低。

表2 不同發酵階段檸檬酒的揮發性成分含量Table 2 Content of volatile components of lemon wine in different fermentation stages

續表2

續表2

2.3 感官分析

FP法是近年來廣為應用的快捷高效的感官評價方法，該方法要求感官評價人員對樣品的感官屬性進行強弱排序，從而對樣品進行區分。由圖2可知，6個發酵階段的檸檬酒樣品可被區分開。f-0和f-10均位于Y軸的左側，但是相距較遠，因發酵期酵母菌生長繁殖活動最為旺盛，利用糖類產生了大量乙醇。但是發酵完成后檸檬酒被轉入陳釀罐中，并置于4 ℃的低溫下，這極大地抑制了酵母的生命活動，再加上發酵過后可供利用的糖類物質大量減少，導致陳釀期間的檸檬酒品質變化相對較小。a-7和a-14的檸檬酒在載荷圖中相距較近，a-42和a-28也較為接近，說明它們具有相似的感官性質。

圖2 不同發酵階段檸檬酒的GPA載荷圖Fig.2 GPA load diagram of lemon wine in different fermentation stages

由圖3可知，f-0位于檸檬香(香氣)組群附近，這說明檸檬汁在檸檬香(香氣)方面表現突出，這與揮發性成分的測定結果保持一致，萜烯類化合物賦予檸檬特殊的香氣，而檸檬汁中萜烯類化合物的含量最多。f-10、a-7、a-14均位于黃色(外觀)和酸味(風味)附近，說明它們在這兩方面表現接近。a-28更靠近酒精味(香氣)，這與酒精度測定結果保持一致，a-42與澀味(風味)、苦味(風味)更為接近。綜合感官評價，a-28的感官品質更好。

圖3 不同發酵階段檸檬酒的GPA感官屬性載荷圖Fig.3 GPA sensory attribute load diagram of lemon wine in different fermentation stages注：P1-P12表示第1-12位評價人員；ar代表香氣類感官屬性; f代表風味類感官屬性;ap代表外觀類感官屬性; at代表風味類感官屬性

3 結論與討論

以尤力克檸檬為原料釀造檸檬酒，對f-0、f-10、a-7、a-14、a-28、a-42檸檬酒的理化指標、揮發性組分和感官品質進行研究。結果表明：隨陳釀時間的延長，可溶性固形物含量逐漸降低，酒精度逐漸升高，并在a-28達到峰值，此后酒精度有所下降。酸類物質在陳釀過程中不斷積累，pH也呈現下降的趨勢。不同發酵和陳釀時期的檸檬酒的色澤并未呈現明顯變化趨勢。a-28和a-42的理化指標較為相近。

在所有階段的檸檬酒中共檢出109種揮發性成分，包括酯類15種、醇類25種、萜烯類36種、酸類5種、醛酮類14種和其他14種。不同陳釀階段檸檬酒的揮發性成分含量和構成比例均不同，隨陳釀時間的延長，揮發性成分的含量不斷增多，醇類揮發性成分不斷積累，酯類揮發性成分先增加后減少，萜烯類揮發性成分在各階段的檸檬酒中均有檢出，且占比均在40%～60%。酸類、醛酮類和其他類在檸檬酒中的占比均較小，但是醛酮類在檸檬汁中的占比較大。揮發性成分的實驗結果表明a-28和a-42整體較優，二者揮發性成分的構成較為相似。

通過FP法發現不同發酵階段的檸檬酒可以被明顯區分，同時得到的感官實驗數據與檸檬酒理化指標和揮發性成分檢測結果的重合度較高，但是在感官實驗中a-42更靠近于澀味(風味)、苦味(風味)組群附近，而a-28的檸檬酒更靠近于酒精(風味)，所以盡管a-28和a-42在理化指標和揮發性成分的構成上較為相似，但是a-28的感官品質要優于a-42，因此低度發酵檸檬酒的最佳陳釀時間為28 d。