基于PMA-CELL-qPCR的葡萄酒發酵中釀酒酵母活菌計數方法的開發與應用

衛博，王杰，陳亦新，王春光，陳卓君，張柏林，朱保慶

(北京林業大學，林業食品加工與安全北京市重點實驗室，生物科學與技術學院，北京，100083)

酒精發酵是酵母將糖分代謝成酒精和CO2的過程，可賦予葡萄酒濃郁的香氣和獨特的口感。釀酒酵母具有快速的糖消耗能力，因而常被用作酒精發酵過程中主要的發酵劑[1]，由于葡萄酒的味道、顏色和香氣與微生物的生長和代謝密切相關，且只有活性的微生物才會在發酵過程中起作用。因此，有必要建立一種快速和可靠的方法來檢測和識別葡萄酒釀造中的活性微生物。

平板計數法作為一種依賴培養的計數方法，已被廣泛應用于葡萄酒釀造過程中的微生物計數[2-3]。然而，其耗時的生長過程和缺乏對可生存但不可培養(viable but non culturable，VBNC)微生物的計數能力，可能造成測得的微生物群體密度偏低[4]。據報道，在葡萄酒發酵過程中，死亡的微生物和VBNC狀態的微生物可能占微生物總數量的60%以上[5]。

最近，人們研究和開發了以微生物菌株DNA為模板的分子計數方法，以取代依賴培養的計數方法[6-7]。實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)已經作為一種特定的區別于依賴培養的檢測方法，應用于測量各種培養基條件下的微生物數量[8]。然而，qPCR技術缺乏區分死菌和活菌DNA的能力。這可能造成死菌DNA的錯誤擴增，并進一步導致對微生物數量的高估[9]。據報道，疊氮溴化丙啶(propidium monoazide，PMA)的引入可提高qPCR技術對微生物計數的準確性[10]。PMA作為一種光敏的DNA配體染料，可以穿透死菌的細胞膜，在強光下進一步交聯死菌細胞的DNA，來自死菌細胞DNA的qPCR擴增被抑制[11-12]。同時，活菌細胞擁有完整的細胞膜結構，這使得PMA無法進入細胞膜與DNA發生作用[7]。

針對活菌的細胞實時定量PCR(CELL-qPCR)方法在計算葡萄酒中的微生物數量方面受到了廣泛關注。這種技術省去了DNA提取過程，直接利用細胞作為qPCR擴增的模板，縮短了反應時間，降低了反應成本[13-14]。目前尚無PMA與CELL-qPCR方法結合監控釀酒過程中微生物動力學的研究。本研究擬開發和優化PMA-CELL-qPCR檢測方法，以準確測定葡萄酒中的活菌，并進一步應用于葡萄酒釀造過程中，以測量微生物的動力學。研究結果有助于闡明葡萄酒發酵過程中的微生物生長機制，并進一步為葡萄酒釀造過程的質量改進提供有益的啟示。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器設備

酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、氯霉素、熒光染料疊氮溴化丙啶(propidium monoazide，PMA)，二甲基亞砜、溶壁酶、酵母DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；商業化釀酒酵母菌株Red Fruit?，意大利Enartis公司；酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養基，美國Difco公司；2x FastStart Essential DNA Green Master，美國 Roche公司， qPCR Mix Plus (ROX)， 愛沙尼亞Solis BioDyne公司。

YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA204電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；VORTEX-5漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，浙江孚夏醫療科技有限公司；WD-9413B凝膠成像分析儀、HB150-S2金屬浴、DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；5425高速離心機，德國艾本德公司；FQD-96A實時熒光定量PCR儀，杭州博日科技有限公司；Q-bit檢測儀，浙江藍景科技有限公司；UV-3300紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司。

1.2 菌種和培養基

YPD固體培養基：加入20 g/L瓊脂于液體培養基內，同時加入100 mg/L氯霉素。

葡萄酒培養基：懷來、平谷兩地赤霞珠葡萄汁。

商業化酵母菌株在YPD培養基中28 ℃下培養24小時。為模擬葡萄酒發酵過程環境，將YPD培養基中培養至對數末期的酵母菌，轉移至相同體積的赤霞珠葡萄汁中培養2 h后，用于后續實驗檢測計數。

1.3 細胞懸浮液處理

對于每個微生物菌株(釀酒酵母)，制備4個細胞懸液樣品，分別為：無PMA處理的活菌細胞(對照)、PMA處理的活菌細胞、PMA處理的死菌細胞、PMA處理的活菌和死菌細胞混合物。為了驗證PMA處理對死菌細胞的功效，將細胞懸液在85 ℃金屬浴中處理20 min，以破壞細胞膜。通過YPD固體培養基培養，確認熱處理后的細胞已經死亡。

1.4 PMA處理的優化

參考LYU等[15]的方法并稍加修改，將PMA溶解在20%(體積分數)的二甲基亞砜中，制備PMA儲備溶液(20 mmol/L)。PMA儲備液在-20 ℃下避光儲存。將不同濃度的PMA溶液加入到1 mL細胞懸液中，產生不同濃度(0、5、10、25、50 μmol/L)的PMA溶液。之后，將PMA處理的細胞懸液在避光條件下200 r/min、4 ℃攪拌20 min。暗反應孵育結束后，將細胞懸液暴露在距離7 cm的450 nm的藍色LED燈下(5 mm，3.7 V，20 mA，2 600 MCD)光活化10 min，完成PMA和細胞DNA的交聯[15]。未經PMA處理的細胞懸浮液被用作陰性對照。

1.4 酵母細胞酶處理條件的優化

使用溶壁酶分解酵母細胞壁。在PMA處理過的細胞懸液中加入一定量的溶壁酶30 ℃培養，具體優化條件如表1所示。隨后，將細胞懸液在4 000 r/min離心10 min，收集酵母細胞。細胞顆粒用無菌蒸餾水洗滌2次。

表1 溶壁酶優化條件Table 1 Optimised conditions for lyticase

1.6 DNA提取

從培養基和葡萄酒中各取1 mL細胞懸液，用酵母DNA提取試劑盒提取酵母DNA。取細胞懸液12 000 r/min離心1 min收集菌體，去上清液，然后加入山梨醇，溶壁酶進行破壁處理，4 000 r/min離心10 min收集沉淀，后續提取過程遵循酵母DNA提取試劑盒步驟。

1.7 引物

實驗最初選用3對引物對酵母進行擴增，并最終選用引物(S.c-f：5′-ACATATGAAGTATGTTTCTATATAACGGTG-3′；S.c-r：5′-TGGTGCTGGTGCGGATCTA-3′)對釀酒酵母進行定量，引物的序列和特征列于表2。

表2 釀酒酵母引物序列Table 2 Primer sequences of S.cerevisiae

1.8 qPCR條件

PCR擴增反應體系為25 μL，包括：2× FastStart Essential DNA Green Master、qPCR Mix Plus (ROX) 12.5 μL，正反引物各1 μL， DNA模板2 μL或細胞模板10 μL，剩余體積無菌水補充。

qPCR擴增條件：95 ℃預變性15 min，40個循環：95 ℃變性15 s，然后60 ℃退火/延伸20 s。熔解曲線從60 ℃緩慢加熱到95 ℃，每隔5 s加熱0.5 ℃，連續收集熒光得到。對擴增的DNA進行熔解曲線分析以確定反應的特異性。所有的分析都是在C100TM熱循環儀、FQD-96A實時系統中進行。通過將qPCR的循環閾值(cycle threshold，Ct)與不同細胞濃度(102～109CFU/mL)作圖得到標準曲線。

1.9 PMA-CELL-qPCR方法應用于葡萄酒

將2個不同產地的葡萄去梗并擠壓成葡萄汁。然后對葡萄汁進行膜過濾殺菌，將生長至106CFU/mL的釀酒酵母接入葡萄汁以啟動酒精發酵。在發酵期間，每2～3 d對葡萄酒進行采樣。使用CELL-qPCR、PMA-CELL-qPCR和平板計數法測量葡萄酒樣品中的釀酒酵母細胞量。

1.10 數據統計分析

實驗均平行3次，數據均使用GraphPad Prism軟件分析。采用5%顯著性水平的t檢驗來確定不同方法間的差異。對PMA-CELL-qPCR和CELL-qPCR標準曲線進行統計分析，在Tukey多重比較檢驗下采用單因素方差分析，以確定基質對細胞定量能力的影響。使用Duncan多重比較檢驗下的單因素方差分析，以確定PMA-CELL-qPCR檢測的特異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 最佳PMA濃度的確定

使用不同濃度的PMA分別處理細胞濃度為107CFU/mL的活菌細胞和熱致死細胞，然后用CELL-qPCR技術進行計數，將其Ct與未經PMA處理的活菌細胞進一步比較，以確定最佳的ΔCt值。ΔCt按公式(1)計算：

ΔCt=Ct處理-Ct未處理

(1)

由圖1所示，熱致死細胞的ΔCt值隨著PMA處理濃度的增加而增加。5 μmol/L PMA處理組活釀酒酵母細胞與未經PMA處理的熱致死細胞相比，ΔCt只增加了0.34(P>0.05)，這表明PMA可以穿過熱致死細胞的細胞膜與DNA相互作用，并抑制qPCR中的DNA擴增。在進行CELL-qPCR擴增之前，PMA處理過的熱致死細胞還要用溶壁酶處理。用5 μmol/L PMA處理的熱致死細胞與未經PMA處理的活菌細胞相比，ΔCt差異顯著(P<0.05)，這表明釀酒酵母的細胞壁結構并沒有阻止PMA分子進入細胞。在PMA濃度為25 μmol/L和50 μmol/L的情況下，對熱致死細胞的抑制作用最高。然而，PMA濃度為50 μmol/L時，活菌細胞的DNA擴增也受到顯著抑制(P<0.05)。濃度在5～25 μmol/L的PMA處理對活菌細胞的DNA擴增無負面作用。

圖1 PMA濃度對釀酒酵母活/死細胞的 PMA-CELL-qPCR信號的影響Fig.1 Effect of PMA concentration on PMA-CELL-qPCR signals of live/dead cells of S.cerevisiae注：不同大寫字母表示不同組間死菌細胞差異顯著，不同小寫 字母表示不同組間活菌細胞差異顯著(P<0.05)

實驗結果表明，高濃度的PMA通過與熱致死細胞的DNA相互作用，能夠完全抑制死菌DNA擴增。然而，過量的PMA分子在CELL-qPCR中抑制了活菌細胞DNA擴增。類似的研究也有報道，PAN等[17]發現50 μmol/L 的PMA對李斯特菌活菌有輕微的細胞毒性效應，SHAO等[18]使用高濃度的PMA處理保加利亞乳桿菌時，其細胞計數明顯減少，但目前這一現象的機制還未被闡明。本研究中，釀酒酵母的最佳PMA處理濃度為25 μmol/L，此濃度下，死菌細胞的DNA擴增被完全抑制，且對活菌細胞DNA擴增無負面作用。

2.2 酵母CELL-qPCR樣品預處理的優化

本研究中直接以細胞為模板與從細胞中提取的DNA為模板進行qPCR擴增，兩者Ct值有明顯差異。ANDORR等[19]研究表明，釀酒酵母的細胞壁可能是造成Ct值差異的原因。在本研究中，對釀酒酵母進行PMA處理后，進一步對其進行溶壁酶破壁處理。溶壁酶處理有助于降低Ct值，提高檢測靈敏度和限度。

由圖2-a所示，對照組(DNA模板)的Ct值與未經溶壁酶處理的釀酒酵母細胞相比，存在顯著差異(P<0.05)。在溶壁酶處理30 min后，細胞的Ct值明顯下降(P<0.05)。表明釀酒酵母的細胞壁結構抑制了CELL-qPCR檢測下的DNA擴增。在進行45 min的溶壁酶處理后，以細胞為模板與從細胞中提取的DNA為模板進行qPCR擴增，兩者Ct值差異明顯縮小。而將溶壁酶處理時間延長到60 min并沒有明顯改變Ct值(P>0.05)。對于不同溶壁酶濃度的影響，如圖2-b所示，與對照組相比，溶壁酶處理后的樣品表現出較低的Ct值。使用CELL-qPCR在75 U的溶壁酶處理下，釀酒酵母細胞的Ct值與qPCR的量化結果相似。與75 U的溶壁酶濃度相比，100 U溶壁酶濃度的Ct值無明顯變化(P>0.05)。因此，釀酒酵母溶壁酶預處理的最佳條件為溶壁酶75 U處理45 min。這也是第一項為CELL-qPCR定量而對釀酒酵母進行的溶壁酶處理的優化研究。

2.3 培養基環境下的標準曲線

為了驗證CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法對細胞的計數，將這些方法的擴增量與qPCR在相同細胞懸浮液下的DNA擴增量進行了比較。表3顯示了Ct值與細胞濃度之間的相關性。

a-溶壁酶處理時間；b-溶壁酶濃度圖2 釀酒酵母PMA-CELL-qPCR預處理條件優化Fig.2 Optimization of the pretreatment conditions of S.cerevisiae PMA-CELL-qPCR注：不同字母表示不同組間差異顯著(P<0.05)

表3 在培養基和葡萄酒中使用特異性引物構建的 qPCR、CELL-qPCR、PMA-CELL-qPCR的 標準曲線的相關系數、效率(平板計數值與循環閾值的對數)和檢測限Table 3 Correlation coefficients, efficiencies of standard curves (log of plate count value vs.cycle threshold) and detection limit constructed by qPCR, CELL-qPCR, PMA-CELL-qPCR using specific primers in culture and wine

如圖3所示，qPCR方法在102～108CFU/mL的細胞濃度范圍內具有良好的線性關系，其線性相關系數高于0.99(R2>0.99)。與qPCR方法相比，CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法在檢測限上表現出明顯的差異。在CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法下，釀酒酵母在細胞濃度為103～107CFU/mL建立了線性相關關系。在本研究中，所有的擴增方法都顯示出良好的擴增效率(0.9～1.1)，qPCR的表現略勝于其他2種檢測方法(表3)。然而，CELL-qPCR的相關系數、擴增效率都與qPCR方法相當，且省去了DNA提取過程，加快了檢測速度，減少了檢測成本。因此，在對菌株進行定量分析時，CELL-qPCR可以作為qPCR的替代方法。此外，使用PMA-CELL-qPCR方法繪制的釀酒酵母標準曲線在檢測限、相關系數和擴增效率等方面都與CELL-qPCR方法下的標準曲線相似。這表明PMA-CELL-qPCR方法同樣具有良好的穩定性，可以作為量化活性微生物的方法。

圖3 釀酒酵母在培養基中標準曲線Fig.3 Standard curve of S.cerevisiae in the medium matrix

2.4 死菌對PMA處理效率的影響

本研究中的PMA-CELL-qPCR方法是為了監測葡萄酒發酵過程中的活菌數量而提出的。因此，有必要評估葡萄酒發酵過程中的死菌細胞是否會影響該方法的準確性。為了評估死菌如何影響PMA的處理效率，取3個濃度的熱致死細胞(103、105、107CFU/mL)與活菌細胞(103、107CFU/mL)按1∶1(體積比)混合。比較使用和不使用PMA處理的混合細胞樣品的Ct值。ΔCt按照公式(2)計算：

ΔCt=Ct活菌-Ct活死菌混合

(2)

當使用CELL-qPCR對微生物種群進行定量時，隨著活菌細胞中熱致死細胞濃度的增加，樣品Ct值也明顯增加(圖4)，這表明CELL-qPCR方法不能區分死菌和活菌。

a-103 CFU/mL活菌;b-107 CFU/mL活菌圖4 不同濃度死細胞對PMA-CELL-qPCR檢測 103和107 CFU/mL釀酒酵母的影響Fig.4 Effects of concentrations of dead cells on the detection of 103 and 107CFU/mL S.cerevisiae by PMA-CELL-qPCR注：不同大寫字母表示不同組未經PMA處理差異顯著，不同 小寫字母表示不同組間PMA處理差異顯著(P<0.05)

如圖4-a所示，PMA處理使CELL-qPCR的活菌細胞定量得到明顯改善，活菌細胞(103CFU/mL)與103和105CFU/mL熱致死細胞混合，與單純的活菌細胞相比，Ct值差異不顯著(P>0.05)。在與107CFU/mL熱致死細胞混合的活菌細胞樣品中，ΔCt值明顯增加(P<0.05)。表明過量的死菌會降低PMA分子與DNA分子相互作用的效率[20]。當活菌數量≤死菌數量時，PMA-CELL-qPCR方法可以有效抑制死菌的擴增。TAKAHASHI等[21]研究發現，當活菌與死菌的比例高于1∶1 000時，PMA-qPCR可以準確地量化活的金黃色葡萄球菌的數量，與本研究結果一致。

對于濃度為107CFU/mL的活菌細胞，加入3個濃度水平的熱致死細胞并沒有改變ΔCt值(P>0.05)(圖4-b)，表明PMA-CELL-qPCR定量分析可以在高水平活菌條件下取得更可靠的結果，死菌產生的干擾可被PMA有效地消除。值得注意的是，當死菌與活菌比例高于10 000∶1時，PMA-CELL-qPCR測定可能產生0.5 lg CFU/mL的細胞定量檢測誤差。當死菌與活菌比例低于100∶1時，PMA-CELL-qPCR方法可以消除死活菌的錯誤判斷，提供準確可靠的活菌群體定量。

2.5 葡萄酒中標準曲線

由圖5所示，在葡萄酒基質中，使用CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法在細胞濃度為103～107CFU/mL時觀察到線性標準曲線。這與YPD培養基中觀察到的釀酒酵母群體的標準曲線相似(圖3)。同時，2種方法的標準曲線都表現出良好的重復性(R2>0.98)(表3)。對于PMA-CELL-qPCR的標準曲線，平谷葡萄酒和懷來葡萄酒中釀酒酵母的擴增效率分別為1.012和1.085，與CELL-qPCR技術下的擴增效率相當，表明葡萄酒環境中的PMA預處理并不影響釀酒酵母的擴增準確性。PMA-CELL-qPCR和CELL-qPCR在監測葡萄酒基質中的釀酒酵母種群方面可以發揮類似的作用，PMA-CELL-qPCR方法可以替代CELL-qPCR方法檢測葡萄酒發酵過程中的釀酒酵母菌群動態變化。

a-平谷葡萄酒；b-懷來葡萄酒圖5 釀酒酵母在葡萄酒基質中標準曲線Fig.5 Standard curve of S.cerevisiae in wine matrix

2.6 PMA-CELL-qPCR在葡萄酒中的應用

選取平谷和懷來2個地區的赤霞珠葡萄榨汁滅菌(不含酵母)，研究是否可以利用PMA-CELL-qPCR方法來監測葡萄酒釀造過程中的活菌群動力學。平谷和懷來葡萄汁的初始還原糖含量如表4所示。

表4 兩個產地葡萄酒在發酵前后的還原糖含量 單位：g/L

在葡萄汁中接種濃度為106CFU/mL的釀酒酵母，以啟動酒精發酵(圖6)。整個酒精發酵過程持續了16 d。采用平板計數、CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法測定2種葡萄酒樣品中的釀酒酵母活菌數。

如圖6-a所示，在平谷葡萄酒中，由于葡萄汁中的營養物質充足，在酒精發酵的初始階段，釀酒酵母迅速生長。在酒精發酵的第6天，釀酒酵母的數量快速增加，并達到了最高濃度(2.57×107CFU/mL)，3種檢測方法顯示了相似的釀酒酵母數量。3種檢測方法顯示了相似的釀酒酵母數量。可能是因為葡萄酒中的高營養水平，大部分的釀酒酵母是有活力的。在酒精發酵的中期階段(第6～12天)，葡萄酒樣品中的釀酒酵母數量保持在107CFU/mL的水平。使用CELL-qPCR檢測方法計算的釀酒酵母數量明顯高于(10倍)實際存活的菌株數量，釀酒酵母的變化隨著酒精發酵過程的進行而增加，通過CELL-qPCR測定的釀酒酵母菌濃度比實際活菌濃度高104倍。可能是因為釀酒酵母的細胞壁結構可以延遲細胞的降解，從死亡的釀酒酵母中釋放的DNA分子可以在葡萄酒中保持一定的時間[22]。酒精發酵后期(第12～16天)，釀酒酵母的數量明顯減少，可能是由于葡萄酒中營養水平降低以及還原糖含量的減少導致的。在發酵結束后的一段時間內，有活力的釀酒酵母數量不斷減少。

如圖6-b所示，在懷來葡萄酒的發酵過程中，經平板計數、CELL-qPCR和PMA-CELL-qPCR方法證實，在酒精發酵的初始階段，釀酒酵母細胞濃度快速增至107CFU/mL。然而，與平板計數法和PMA-CELL-qPCR方法相比，CELL-qPCR方法對菌株的計數結果在葡萄酒的其余釀造期(第6～20天)均表現出差異。用PMA-CELL-qPCR方法測定的葡萄酒中的活菌細胞數與用平板計數法測定的結果相似。酒精發酵結束后，由于還原糖含量減少，釀酒酵母數量呈下降趨勢。表明不同的葡萄酒基質對死菌的降解速度以及死菌釋放的DNA可能起到不同的作用。

a-平谷葡萄酒發酵；b-懷來葡萄酒發酵圖6 通過不同方法對葡萄酒釀造過程中 釀酒酵母進行定量分析Fig.6 Quantitative analysis of S.cerevisiae during wine brewing determined by different methods

由于2種葡萄酒樣品都存在大量的死菌，CELL-qPCR方法顯示死菌與活菌數量存在巨大差異。然而，在PMA-CELL-qPCR和平板計數法之間發現細胞群計數誤差僅為0.5 lg CFU/mL，可能是由于發酵過程葡萄酒體系中存在大量VBNC狀態的微生物。與本研究結果類似，使用qPCR、PMA-qPCR和平板法計數Majiapo葡萄酒中釀酒酵母動態變化時，qPCR與平板計數相差一個數量級，而PMA-qPCR與平板結果擬合較好[19]。與本實驗不同的是，以DNA為模板的擴增在提取DNA過程中會去除環境DNA干擾因素，相比CELL-qPCR，qPCR計數方法與平板計數誤差小于本研究中結果。

圖6中，PMA-CELL-qPCR方法確定的釀酒酵母細胞計數結果與平板計數法測量的結果相當一致，表明PMA-CELL-qPCR可以準確、可靠地測定葡萄酒中的活體微生物。更重要的是，這種技術可以在不考慮微生物濃度水平的情況下直接檢測和量化葡萄酒中的活性微生物群體。

3 結論

本研究通過將PMA與CELL-qPCR相結合，優化了PMA處理濃度、CELL-qPCR前處理方法，并最終利用PMA-CELL-qPCR準確定量，開發的PMA-CELL-qPCR計數方法能夠準確量化葡萄酒相關基質中的釀酒酵母的活菌數量。且這種檢測方法省略了DNA提取過程，可以將死菌與活菌區分開來，同時降低假陽性結果出現的可能。此外，與葡萄酒釀造過程中的傳統平板計數法相比，PMA-CELL-qPCR表現出了一致的計數結果，極大提升了工作效率。該方法在食品領域具有潛在的應用前景，為葡萄酒及果酒產品發酵過程中活菌快速檢測提供了新的參考方法。