植物乳桿菌P-8對小鼠腸道菌群及抗氧化抗炎能力的研究

胡夢瑩，徐浩原，韓金鵬，張連中，牛策，王志斌

1(北京中醫藥大學 中藥學院，北京，100029)2(北京聯合大學 生物化學工程學院，北京，100023) 3(北京鴻測科技發展有限公司，北京，100176)

腸道菌群絕大多數屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)[1]，其中擬桿菌門主要包括擬桿菌屬﹑普氏菌屬和木桿菌屬，厚壁菌門主要包括梭狀芽孢桿菌屬﹑乳桿菌屬和瘤胃球菌屬以及產丁酸鹽的Eubacterium、Fecalibacterium和Roseburia[2]。

腸道菌群與免疫系統相互協調，在維持宿主的健康中發揮著重要作用。腸道菌群(擬桿菌屬、乳桿菌屬等)可以誘導抗菌肽、免疫球蛋白A的表達，從而防御病原體[3]。腸道菌群也可以通過激活自身表位進而驅動Th1、Th17和調節性T細胞(CD4+、CD25+、Foxp3+)分化、B細胞反應，促進機體對無害抗原的耐受，參與宿主的免疫應答和組織修復[4]。腸道菌群及其代謝產物還可以與免疫系統相互作用，傳遞促進免疫細胞成熟和免疫功能正常發育的神經信號[5]，還可以通過抑制組蛋白去乙?；?，并激活GPR41、GPR43、TLR4-TRIF信號通路以促進缺氧誘導因子lα(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)及芳香經受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)、干擾素刺激基因的表達，促進細胞因子白介素(IL-6、IL-22、IL-18等)的產生，從而調節腸道巨噬細胞的活性，促進病原體清除，維持免疫內環境的穩定和阻止自身免疫疾病的發展[6-7]。

腸道菌群的組成、結構或分布等發生變化時，就會打亂宿主體內平衡，影響宿主代謝，從而導致疾病。但是這種平衡狀態極易受外界環境和宿主自身因素的影響。目前，科學領域中最為認可的、能夠快速且有效調節腸道菌群、修復腸道微生態的主要途徑為補充益生菌[8]。適當劑量益生菌可協助恢復腸道屏障的完整性，并引起腸道微生物群結構和功能的有利變化[9]。目前，研究較多的益生菌主要包括乳桿菌和雙歧桿菌屬。植物乳桿菌為乳桿菌屬，圓端直桿菌，單個、成對或短鏈狀，革蘭氏陽性，無芽孢，兼性厭氧，通常最適溫度為30 ℃～35 ℃(T/CSWSL 005—2018 《飼料添加劑 植物乳桿菌》)，其代謝產物有機酸能夠抑制有害微生物的生長。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)P-8是一株2005年從內蒙古巴彥淖爾草原牧民家庭中自然發酵酸牛乳中分離獲得的菌株[10]，有很強的抗菌活性，對酸性環境和膽鹽有良好的耐受力，在pH 2.5的人工胃液中處理3 h后存活率達90.16%，在pH 8.0的人工腸液中處理24 h，活菌數不受影響[11]。植物乳桿菌P-8可以通過其表面蛋白黏附定植于人體腸道中，定植時間超過4個月[12]。定植于腸道后，一方面與有害菌競爭營養物質，另一方面代謝產生多種具有抑制有害菌功能的物質(乳酸﹑細菌素和雙乙酰等)，從而抑制病原菌在腸道的定植，進而改善腸道微生物菌群的平衡[13]。另有研究發現，在日糧中添加植物乳桿菌P-8可顯著提高肉雞42日齡腸道中總細菌、乳桿菌屬、鏈球菌屬、梭桿菌亞種和雙歧桿菌屬等有益菌的數量，同時極大降低埃希氏菌屬、脫硫弧菌屬和彎曲桿菌屬等潛在致病菌的數量[14]。

目前，植物乳桿菌P-8因其能夠在腸道中長期穩定的定植并發揮益生功能，在家禽生產應用上得到廣泛研究。其在人用產品生產應用上的研究主要集中在對腸道菌群的影響及改善抑郁癥狀，對于植物乳桿菌P-8是否具有抗氧化和抗炎功能尚未報道。本研究采用植物乳桿菌P-8灌胃健康小鼠，考察其對小鼠腸道菌群的影響，同時研究其對小鼠的抗氧化能力和抗炎反應，以期為揭示植物乳桿菌P-8的益生、保健功能及相關益生菌制劑的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級BALB/c雄性小鼠52只，體質量18～20 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017—0038。所有小鼠飼養于北京聯合大學應用文理學院SPF級動物房，飼養室溫度為(20±2) ℃，相對濕度為45%～60%。本研究動物實驗設計和實施方案通過了北京聯合大學倫理委員會審核和批準(實驗動物倫理委員會意見書編號2021—6)。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)P-8，北京科拓恒通生物技術股份有限公司；谷胱甘肽(glutathione, GSH)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；伊紅美藍瓊脂(eosin-methylene blue, EMB)培養基、腸球菌培養基(疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂)、雙歧桿菌瓊脂培養基(BBL)、乳桿菌選擇性培養基(LBS瓊脂)、胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基，北京陸橋技術股份有限公司；ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

LB943酶標儀，Bert hold Technologles；JA2003電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TGL-16M離心機，湖南湘儀實驗室儀器款開發有限公司；WH-1漩渦混合器，常州市凱航儀器有限公司；SMART-N超純水機，上?？道追治鰞x器有限公司；UV—1800紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；WDX4000熒光儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及分組處理

將52只Balb/c雄性鼠，適應性飼養7 d后，隨機分為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組13只，低、中、高劑量組每天分別按照2.5×107、5×107、1.5×108CFU/kg劑量灌胃植物乳桿菌P-8，空白組灌胃等體積的生理鹽水，連續灌胃30 d。實驗過程中小鼠自由攝食和飲水。灌胃期間每天監測小鼠體質量和攝食情況并記錄。

1.3.2 小鼠糞便細菌計數

分別在灌胃的第0天和第30天，無菌操作取小鼠糞便0.1 g，加稀釋液后振蕩混勻，按照10倍梯度稀釋至10-8，分別用EMB培養基、腸球菌培養基、LBS瓊脂培養基、BBL培養基和胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基，于37 ℃培養箱中，厭氧或有氧條件下培養24～48 h，觀察菌落形態和生化反應等，對平板上的菌落進行計數并鑒定，計算糞便中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌及產氣莢膜梭菌的活菌數(lg CFU/g)。

1.3.3 小鼠糞便的16S rDNA高通量測序分析

在灌胃植物乳桿菌P-8的30 d后，采集各組小鼠的新鮮糞便作為樣品，對小鼠糞便樣品進行DNA提取和檢測，利用引物515F和806R對細菌16S rRNA的V3～V4區進行擴增，純化PCR產物，構建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq測序平臺進行高通量測序，利用QIIME對97%的相似水平下聚類而成的操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)進行生物信息統計分析和物種注釋分析，樣品數據進行均一化處理，獲得物種豐度及多樣性等數據。

1.3.4 臟器系數和腸道長度測定

灌胃30 d后，將小鼠脫頸處死解剖，之后取出心、肝、脾、肺、腎等臟器稱質量，再根據小鼠的體質量，按公式(1)計算臟器系數。測量小腸質量及長度，比較各組小鼠小腸質量和長度的變化。

臟器系數/%=臟器平均質量(g)/平均體質量(g)×100

(1)

1.3.5 抗氧化水平測定

小鼠解剖后取出小腸、肝臟組織，利用試劑盒測定小腸、肝臟組織中T-SOD、MDA、GSH及GSH-Px含量。

1.3.6 炎癥因子水平測定

小鼠剪眼球取血后離心，取血清，利用酶標儀和ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-6的含量。

1.4 統計學方法

用SPSS 19.0進行顯著性分析，采用單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)，所有數據均以平均值±標準偏差表示。小鼠糞便細菌計數實驗采用獨立樣本t檢驗，各組自身前后比較采用成對t檢驗。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌P-8對小鼠體質量、攝食的影響

如圖1所示，實驗整個過程中，各組小鼠的體質量緩慢增加，且各組差異不顯著(P>0.05)，組間攝食、飲水量無顯著性差異(P>0.05)，表明植物乳桿菌P-8干預對健康小鼠體質量及攝食無影響。

2.2 植物乳桿菌P-8對小鼠臟器系數的影響

對小鼠體質量和臟器系數的影響是評價益生菌安全性的重要指標，其中臟器系數可反映動物內臟的功能狀態，一般選用肝、腎、腦、肺、脾、心等主要臟器進行試驗。正常時各臟器與體質量的比值相對恒定。當出現感染等異?，F象時，受損臟器質量會發生改變。由表1可知，空白組及低、中、高劑量組小鼠各臟器系數不存在顯著性差異(P>0.05)。一般來說，臟器系數增大，表示臟器水腫或增生肥大等；臟器系數減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[15]。本研究中并未觀察到相關現象，表明灌胃植物乳桿菌P-8對小鼠臟器無不良影響。

表1 植物乳桿菌P-8對小鼠臟器系數的影響(n=13)Table 1 Effect of L.plantarum P-8 on organ coefficient of mice(n=13)

2.3 植物乳桿菌P-8對小鼠小腸長度和質量的影響

對小鼠的小腸長度和質量進行了測定，該指標反映了小鼠對營養物質的消化吸收能力，與機體的健康狀況相關。如圖2所示各組間的小腸長度和質量無顯著差異。表明灌胃植物乳桿菌P-8對小鼠小腸沒有產生影響。

a-小腸質量；b-小腸長度圖2 植物乳桿菌P-8對小鼠小腸質量和 長度的影響(n=13)Fig.2 Effect of L.plantarum P-8 on small intestinal in mice(n=13)

2.4 植物乳桿菌P-8對小鼠抗氧化能力和抗炎反應的影響

2.4.1 植物乳桿菌P-8對小鼠小腸、肝臟組織抗氧化能力的影響

SOD、GSH、GSH-Px、MDA是反映機體內氧自由基代謝的主要指標，其中SOD、GSH、GSH-Px可有效地清除氧自由基，從而阻止脂質過氧化。MDA含量與體內脂質過氧化的程度呈正相關，間接地反映細胞受損程度[16]。對各組小鼠小腸及肝臟組織中氧化應激相關指標進行檢測，結果如表2所示。

表2 植物乳桿菌P-8對小鼠小腸組織T-SOD、 MDA、GSH和GSH-Px的影響(n=13)Table 2 Effect of L.plantarum P-8 on T-SOD, MDA, GSH and GSH-Px level in small intestine of mice (n=13)

在小腸組織中，與空白組小鼠相比，高劑量組小鼠的GSH水平及GSH-Px、T-SOD活力顯著升高(P<0.05)；MDA水平顯著降低(P<0.05)。在肝臟組織中，與空白組小鼠相比，高劑量組小鼠的GSH水平及GSH-Px、T-SOD活力顯著升高(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)，中劑量組GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)，說明植物乳桿菌P-8能夠提高小鼠小腸和肝臟的抗氧化能力，加強小鼠小腸、肝臟內的氧化防御系統功能，幫助機體抵御氧化應激。

2.4.2 植物乳桿菌P-8對小鼠抗炎癥反應的影響

IL-1β等促炎因子和炎癥反應關系密切，當感染或某些其他疾病出現時，IL-1β能快速被誘導升高，啟動免疫功能，引起機體正常組織受損[17]。IL-1β的升高可以通過刺激炎癥產生，影響內臟敏感性，引起腸易激綜合征[18]。研究表明，在許多癌癥中IL-6的表達會升高，如皮膚癌、乳腺癌、肺癌等[19]。對各組小鼠血清中IL-1β和IL-6水平進行分析，如圖3所示，與空白組相比，高劑量組血清中IL-1β、IL-6顯著降低(P<0.05)，說明植物乳桿菌P-8能夠有效降低小鼠機體中的炎癥因子水平，低水平的IL-1β、IL-6 可提高細胞免疫反應、激活機體防御功能[20]。

a-IL-1β;b-IL-6圖3 植物乳桿菌P-8對小鼠IL-1β和 IL-6的影響(n=13)Fig.3 Effect of IL-2, TNF-α, IL-1β and IL-6 in small intestine of mice by L.plantarum P-8(n=13)

2.5 益生菌對小鼠腸道微生物的影響

2.5.1 植物乳桿菌P-8對常見腸道微生物的影響

由表3可見，灌胃受試物前，空白組及低中高各劑量組的腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產氣莢膜梭菌菌落總數無顯著性差異(P>0.05)，灌胃30 d后，空白組和低、中劑量組各類微生物數量與灌胃前相比無顯著性差異，而高劑量組與灌胃前相比乳桿菌、雙歧桿菌的數量顯著增加(P<0.05)。

表3 植物乳桿菌P-8對小鼠腸道菌群的影響(n=13) 單位：lg CFU/g

2.5.2 植物乳桿菌P-8對腸道微生物多樣性的影響

從門水平上(圖4-a)分析物種組成發現，各組主要以擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主，空白組中擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門分別占61.76%、27.83%、0.82%，占總序列數的90.42%。與空白組相比，高劑量組中擬桿菌門的豐度下降至44.12%；厚壁菌門和變形菌門的豐度分別上升至45.00%、2.43%。

從屬水平上(圖4-b)分析物種組成發現，以擬桿菌屬(Bacteroides)、Lachnospiraceae_NK4A136_group屬、理研菌屬(Alistipes)和乳桿菌屬(Lactobacillus)為主。

對各組進行差異物種分析(圖5)，在屬水平上，與空白對照相比，低劑量組Lactobacillus的豐度顯著增加(P<0.05)，中高劑量組Lactobacillus的豐度極顯著上升(P<0.01)；高劑量組Odoribacter的豐度極顯著增加(P<0.01)，Muribaculum、芽孢桿菌屬(Bacillus)的豐度顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組小鼠腸道菌群門水平(a)及屬 水平(b)的物種豐度圖Fig.4 Species abundance at phylum(a) and genus(b) level of intestinal microflora of mice in each group

圖5 物種相對豐度聚類熱圖Fig.5 Species abundance from clustering heatmap注：Control-空白組；L-低劑量組；M-中劑量組；H-高劑量組

Lactobacillus具有增強免疫、促進能量代謝、抗炎、調節腸道菌群、降血糖和降血脂等生理活性，其豐度是人體健康的重要指征[21-23]。Lactobacillus在生長代謝過程中，會產生乳酸、醋酸、甲酸、丁酸等代謝產物，這些產物能夠降低體系的pH值，抑制其它一些不耐酸的雜菌的生長[24]，這是大部分乳酸菌的抑菌機制。Odoribacter是人體腸道微生物中常見的一種產生短鏈脂肪酸的微生物，其豐度與非酒精性脂肪肝、囊性纖維化和炎癥性腸病等疾病的發生負相關，是一種與宿主相互作用的有益共生菌[25]。上述結果表明，植物乳桿菌P-8能在一定程度上調節小鼠腸道菌群組成，增加Lactobacillus、Odoribacter等菌屬豐度。

3 結論

本研究探究了植物乳桿菌P-8對健康小鼠腸道菌群、抗氧化能力及炎癥水平的影響。結果表明植物乳桿菌P-8可以有效增加小鼠的小腸和肝臟組織中GSH水平及T-SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平，降低炎癥因子IL-1β、IL-6水平，促進雙歧桿菌、乳桿菌類有益菌的生長。植物乳桿菌P-8在調節腸道微生物組成及抗炎抗氧化方面表現出較好的效果，研究結果為揭示植物乳桿菌P-8的益生、保健功能及相關益生菌制劑的開發利用提供依據。