交替糖蔗糖酶在畢赤酵母中的重組表達、酶學性質及轉化反應研究

戴悅，吳丹，鄭璞，陳鵬程

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

交替糖蔗糖酶(alternansucrase，ASR,EC 2.4.1.140)是GH70家族的4大經典葡聚糖蔗糖酶之一，它可以進行葡萄糖基轉移，催化形成具有α-1,3糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵交替連接的葡聚糖，即交替糖[1]。交替糖只能被異麥芽糖糊精酶和互變酶切割[2]，而對其他微生物和哺乳動物的水解酶具有抗降解性，應用范圍主要涉及納米科技、醫藥、食品、化妝品等領域[3-4]，尤其作為一種具有良好益生功能的新資源食品極具市場開發潛力[5]。

雖然以ASR制備交替糖的研究熱度一直不減，但如今交替糖仍然沒有進入市場得到大規模的應用。此前所報道的野生型菌株生產ASR的最高酶活力為1.5 U/mL[6]，表達水平較低。此外，野生型菌株還存在被其他酶和共合成的聚合物污染、提取純化過程復雜等問題，所以生產過程很不經濟，難以滿足工業化生產的需要[7]。VAN LEEUWEN等[8]在EscherichiacoliTOP10中成功表達ASR，但酶活力幾乎沒有提高。在大腸桿菌中表達的重組菌雖然避免了野生型菌株提取和純化的復雜步驟，但不僅需要進行細胞破碎，且極易形成包涵體[9]，同時由于含有內毒素導致其表達的酶無法用于食品行業。朱潔[10]嘗試了在枯草芽孢桿菌中表達ASR，3 L罐發酵酶活力水平依然較低，僅為3.9 U/mL，所以依靠枯草芽孢桿菌異源表達大規模生產ASR也難以實現。

畢赤酵母(Pichiapastoris)作為表達宿主有眾多優勢[11]，可以克服其他宿主的缺點。本研究選擇P.pastoris作為ASR的異源表達的宿主，將來源于LeuconostocmesenteroidesNRRL B-1355的ASR基因在P.pastoris中實現高水平分泌表達，并進行了重組酶的酶學性質的研究。另外，本文將該酶應用于催化合成交替糖，研究了該酶催化不同受體反應對產物組成的影響，以期為ASR工業化生產以及交替糖大規模的市場應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

菌株E.coliJM109、P.pastorisX33，以及載體pPIC9K均由本實驗保存。E.coliJM109用于ASR基因的克隆和測序實驗。P.pastorisGS115用作異源表達宿主，pPIC9K作為重組ASR的表達載體。ASR基因來源于LeuconostocmesenteroidesNRRL B-1355(GenBank編號為AJ250173.2)。交替糖蔗糖酶基因、實驗所用引物均由天霖生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑

抗生素zeocin，北京索萊寶科技有限公司；PrimeSTAR?Max DNA Polymerase，寶日醫生物技術(北京)有限公司；蛋白質Marker，賽默飛世爾科技；T4 DNA連接酶、一步克隆試劑盒、核酸分子量Marker，諾維贊有限公司；質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養基

LB、YPD、MD、BMGY與BMMY配方參照Invitro-gen公司的《畢赤酵母表達操作手冊》。

PTM1(g/L):CuSO4·5H2O 6，MnSO4·H2O 3，FeSO4·7 H2O 65，NaI 0.08，Na2MoO4·2H2O 0.2，CoCl20.5，H3BO30.02，生物素0.2，濃H2SO45 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體pPIC9K-asr的構建

根據GenBank上發表的ASR基因序列，按照P.pastoris密碼子偏好性進行優化，由天霖生物技術公司合成。以pUC57-ASR為模板，用引物F1、R1擴增ASR基因片段；以pPIC9K質粒為模板，設計引物F2、R2擴增P.pastoris表達載體片段。通過膠回收驗證PCR產物，并使用膠回收試劑盒分別回收ASR基因片段和pPIC9K載體片段。通過一步克隆試劑盒將回收的片段和載體按照2∶1的物質的量比，在37 ℃下反應30 min連接。將連接產物轉化E.coliJM109感受態細胞，涂布卡那霉素抗性平板。使用引物F1和F2進行菌落PCR，篩選陽性轉化子，擴增提取質粒，測序正確后用于轉化P.pastoris。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 重組ASR在P.pastoris中的表達與搖瓶篩選

本研究采用P.pastorisGS115作為表達宿主。P.pastorisGS115感受態細胞根據Invitrogen標準操作流程制備。使用Sac I線性化pPIC9K-asr質粒，用PCR產物純化試劑盒純化回收線性化片段。吸取1 μg線性化片段加入感受態細胞中，冰浴30 min后轉入電轉杯中，在1 500 V下點擊5 ms，迅速加入1 mL 1 mol/L的冰預冷山梨醇，30 ℃孵育2 h后涂布MD平板。在MD平板培養2～3 d后，挑取轉化子進行G418抗性篩選，G418質量濃度分別為0.5、1、2、4 mg/mL。將正確的轉化子接種至BMGY培養基中，30 ℃，220 r/min培養24 h，然后4 ℃，5 000 r/min離心10 min去除上清液得到菌體。用30 mL BMMY培養基重懸菌體，30 ℃，220 r/min培養72 h，每12 h添加終體積分數為1%的甲醇。誘導結束后，4 ℃，7 000 r/min離心5 min收集粗酶液，選擇酶活力最高的菌株用于3 L罐高密度發酵。

1.2.3 重組P.pastoris3 L罐高密度發酵

將搖瓶篩選出的菌株在YPD平板上30 ℃培養48 h，挑取單菌落接種至100 mL YPD培養基中，30 ℃，220 r/min培養至OD600=10～12后，接種至900 mL BSM培養基中。設定初始發酵溫度為30 ℃，pH 5.5，溶氧關聯攪拌控制為20%。出現溶氧反彈之后開始流加500 g/L甘油(含有12% PTM1)，當OD600達到100，停止流加甘油并饑餓培養1 h。誘導階段，將溫度調整至25 ℃，用甲醇控制儀流加開始流加甲醇(含有12% PTM1)，控制溶氧20%～30%誘導產酶。每隔一段時間取樣測定OD600、酶活力，直至OD600和酶活力不再顯著增加，終止發酵。

1.2.4 酶活力的測定

用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法進行ASR的酶活力測定[12]。以1 mL 200 g/L蔗糖溶液為底物，加入0.9 mL酸緩沖液(50 mmol/L，pH 5.5)，在40 ℃水浴鍋中保溫10 min，加入0.1 mL的酶液，40 ℃、pH 5.5反應30 min。吸取0.5 mL反應液，加入1 mL DNS溶液，沸水浴7 min，冰水冷卻，加水定容至5 mL，在540 nm下測定吸光值。根據吸光值計算出果糖濃度。ASR酶活力定義：每分鐘產生1 μmol果糖所需的酶量為1 U的酶活力。

1.2.5 ASR的酶學性質

將高密度發酵所得酶液經過陰離子交換柱純化后，考察溫度和pH對ASR的影響。

最適pH和pH穩定性：在40 ℃條件下，50 mmol/L，pH為3.0～9.0緩沖液內，間隔0.5個pH測定酶活力，按酶活力最高的為100%，計算其他pH下的相對酶活力以確定最適pH；將酶置于50 mmol/L，pH為3.0～9.0緩沖液內，于4 ℃冰箱放置7 d，測定殘留酶活力以確定pH穩定性。

最適溫度和溫度穩定性：采用50 mmol/L，pH 5.5的醋酸緩沖液，在30～60 ℃間隔5 ℃測定酶活力，按酶活力最高的為100%，計算各溫度下的相對酶活力以確定最適溫度；采用50 mmol/L，pH 5.5的醋酸緩沖液，將酶液分別放置在30、35、40、45、50 ℃保溫，每隔一段時間取樣測定殘留酶活力以確定溫度穩定性。

以5、10、20、40、80 g/L的蔗糖為底物，在40 ℃，50 mmol/L，pH 5.5的醋酸鈉緩沖液下測定反應過程中果糖的生成量。根據Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，以1/V對1/S作圖，繪制ASR作用于不同濃度底物的動力學曲線。

1.2.6 交替糖的制備

用pH 5.5的50 mmol/L醋酸緩沖液配制總質量濃度為300 g/L的蔗糖和麥芽糖(或其他小分子糖)溶液，使其物質的量比為2∶1，總反應體系為10 mL，加入0.6 U/mL ASR酶液，置于40 ℃，150 r/min的水浴搖床中反應48 h后，將反應液沸水煮10 min終止反應用于后續分析。或者以300 g/L蔗糖為唯一底物，其他條件同上。

1.2.7 薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)分析

采用TLC來確定最終催化反應體系中生成的單糖和寡糖。以1 mg/mL果糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六塘、麥芽七糖作為marker，點樣量10 μL。將獲得的反應液離心，稀釋10倍，在薄層層析硅膠板上點樣1 μL，展開劑為V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(水)=5∶5∶3[13]。在室溫下將50 mL展開劑在200 mm×100 mm的展開缸中預飽和60 min，放入樣品展開4 h。用12%硫酸甲醇溶液在110 ℃烘箱中顯色30 min，根據TLC顏色變化來定性分析產物的組成。

2 結果與分析

2.1 重組ASR的異源表達

通過PCR擴增的pPIC9K載體以及ASR基因，經過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小分別為7 443和6 150 bp(圖1-a)，使用無縫克隆試劑盒將片段連接后轉化E.coliJM109感受態細胞，涂布卡那霉素抗性平板。將轉化子菌落PCR得到6 150 bp單一條帶(圖1-b)，則為陽性轉化子，測序正確，重組質粒pPIC9K-asr構建成功。

a-PCR擴增電泳圖；b-轉化子的PCR鑒定結果 M-DNA marker；a1-載體pPIC9K的PCR產物； a2-目的基因asr的PCR產物； b1～10-陽性轉化子中asr的PCR產物；b11-對照(pPIC9K)圖1 PCR擴增和轉化子的PCR鑒定結果電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification and identification of transformant

使用SacI線性化pPIC9K-asr質粒，經過PCR產物純化試劑盒回收后，取1 μg電轉化P.pastorisGS115感受態細胞，涂布MD平板生長后，進行抗生素篩選。挑取正確轉化子搖瓶誘導表達后，離心收集上清液粗酶液，測定酶活力(表2)。選定搖瓶酶活力最高的2號菌株，作為3 L發酵罐高密度發酵的菌株。

表2 重組ASR搖瓶水平酶活力Table 2 Recombinant ASR expression activities in shake flask level

2.2 ASR的3 L發酵罐高密度發酵

挑取2號菌株的單菌落接種至100 mL YPD液體培養基中，培養至OD600達到10～12。按體積分數為10%接種量接種至裝有BSM培養基的3 L發酵罐中，分批培養一定時間后，當觀察到溶氧突然上升，即表示發酵罐內基礎培養基中所含的碳源已被菌體耗盡，不能滿足菌體的生長代謝，補加甘油作為碳源來供給菌體正常的生長代謝直至OD600達到100，停止流加甘油。等到溶氧再次反彈后，饑餓培養1 h，開始流加甲醇進行誘導。將發酵過程中所取的樣品進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示，GS115/pPIC9K-asr約在200 kDa處有一條明顯的條帶，與理論蛋白分子質量一致，隨著誘導時間的延長，GS115/pPIC9K-asr目的蛋白條帶逐步加深。發酵過程中，OD600在達到530后(圖2-b)，不再增加，整個誘導過程持續了72 h。ASR的酶活力隨著誘導時間的延長逐步增大，最終達到34.5 U/mL，約是搖瓶水平的12倍。

a-不同時間發酵液上清液SDS-PAGE圖; b-發酵過程中酶活力和細胞OD600曲線圖圖2 3 L發酵罐重組菌發酵過程圖Fig.2 Fermentation of recombinant P.pastoris in 3 L fermenter

2.3 ASR酶學性質的研究

2.3.1 pH對ASR活性的影響

為了探究重組ASR的最適pH，將酶的反應溫度控制為40 ℃，50 mmol/L不同pH緩沖液范圍內探究重組ASR的酶活性。如圖3-a所示，隨著pH的增加，ASR的酶活力先增加后減少，當pH值為6.0時酶活力最大，即重組ASR的最適pH為6.0。

將酶置于50 mmol/L不同pH緩沖液范圍內于4 ℃放置7 d，探究重組ASR的pH穩定性。pH為4.0～9.0時，重組ASR的相對酶活力均在90%以上(圖3-b)，表明重組ASR具有廣泛的pH穩定性。

a-最適pH；b-pH穩定性圖3 pH對重組ASR活性和穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity and stability of recombinant ASR

2.3.2 溫度對ASR活性的影響

為了探究重組ASR的最適溫度，在30～60 ℃下分別考察ASR活性(圖4-a)。在30～55 ℃，ASR均保持50%以上的相對酶活力。當溫度>55 ℃時，重組ASR的酶活力急劇下降，其相對酶活力降至25%以下。ASR酶活力呈現先上升后下降的趨勢，在50 ℃時具有最大值，為最適溫度。

酶的熱穩定性也是酶的一種重要的性質，是實際生產過程中選擇酶反應溫度的重要指標之一，在30～60 ℃下考察酶的熱穩定性，間隔0.5 h取樣測定重組ASR的殘余酶活力(圖4-b)。ASR在不高于40 ℃時具有較好的熱穩定性，在30、35 ℃下保溫24 h仍可維持75%以上的活性；在40 ℃下，ASR的酶活力下降比較緩慢，孵育10 h仍然可以維持50%以上的活力；當溫度>40 ℃時，ASR熱穩定性較差，在50、60 ℃下酶活力幾乎在前1 h就完全喪失。

a-最適溫度；b-溫度穩定性圖4 溫度對重組ASR活性和穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of recombinant ASR

2.3.3 ASR動力學參數測定

以不同濃度的蔗糖為底物，在40 ℃，pH 5.5下測定反應過程中果糖的生成量，即為底物蔗糖的消耗量，以1/V對1/S作圖，繪制ASR的動力學曲線(圖5)。在該動力學曲線中，橫軸的截距即為1/Km,縱軸的截距即為Vmax。根據回歸方程求得，ASR動力學參數Km、Vmax、kcat分別是31.97 mmol/L，0.22 mmol/(min·L)，0.36 s-1。

S-蔗糖的量;V-果糖生成速度圖5 ASR對蔗糖的雙倒數曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plot of ASR using sucrose as substrates

2.4 交替糖的制備及分析

2.4.1 以蔗糖為唯一底物制備交替糖

本研究中采用pH 5.5的50 mmol/L醋酸緩沖液配制總質量濃度為300 g/L的蔗糖加入0.6 U/mL的ASR酶液催化48 h后，稀釋10倍后進行TLC分析，由TLC結果(圖6)可知，當以蔗糖為唯一底物反應時，只有多糖和少量三糖產生，沒有產生更高聚合度的寡糖。

M-標準品marker；G1-葡萄糖；G2-蔗糖；G3～G7麥芽三糖～ 麥芽七糖；S-蔗糖；g-葡萄糖；F-果糖；m-麥芽糖；L-乳糖； T-半乳糖；0-反應0 h樣品；1-反應48 h樣品； 紅色方框表示聚合度超過5的交替寡糖圖6 不同小分子糖受體的催化產物TLC圖Fig.6 Products of ASR reaction with different saccharide receptors

2.4.2 以蔗糖為受體，其他小分子糖為供體制備交替糖

選擇了容易獲取且價格較為低廉的葡萄糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖作為制備交替糖的受體。控制蔗糖和其他小分子糖的物質的量比為3∶1，用pH 5.5的50 mmol/L醋酸緩沖液配制總質量濃度為300 g/L的總底物量，加入0.6 U/mL的酶催化48 h后，稀釋10倍后進行TLC分析(圖6)。當蔗糖為供體，受體是海藻糖時，沒有觀察到任何寡糖的產生，產物中只有多糖；乳糖、果糖為受體時，產物是三糖和多糖；葡萄糖、麥芽糖為受體時，產物是多糖和多種寡糖的混合物，并且由葡萄糖生成的產物聚合度比麥芽糖的低、顏色比麥芽糖的淺。進一步考察了麥芽糖為受體時的催化反應過程，通過每隔8 h取樣，使用TLC分析詳細記錄反應過程中底物的消耗、產物的生成情況，如圖7所示，隨著時間的延長，產物中有聚合度為3～7甚至更高的寡糖產生。

M-標準品marker；G1-葡萄糖；G2-蔗糖； G3～G7-麥芽三糖～麥芽七糖圖7 麥芽糖為受體的催化產物TLC圖Fig.7 Products of ASR reaction with maltose receptors

3 結論與討論

本研究將來源于ASR的基因首次在P.pastoris中成功實現高水平分泌表達，酶活力達到34.5 U/mL。這是ASR首次在真核宿主中異源表達，同時也是目前所報道的ASR最高酶活力水平，解決了ASR酶活力較低的問題，有助于對ASR開展進一步深入的研究。重組ASR廣泛的pH穩定性和較好的溫度穩定性表明了其具有應用于工業食品生產的巨大潛力。在以不同底物生產交替糖時，以蔗糖為唯一底物幾乎可以專一性生產交替糖多糖，這一特性可應用于交替糖多糖的生產。當蔗糖為供體，其他小分子糖為受體時，只有麥芽糖可以生產較高聚合度的寡糖產物，其他小分子糖只能生成多糖和聚合度較低寡糖的混合物。研究結果一方面擴大了交替糖多糖生產的底物范圍，另一方面說明麥芽糖是生產交替糖寡糖的良好受體。由此可見，本研究重組表達的ASR具有良好的生產交替糖功能，為后續規?；苽浣惶嫣翘峁┲匾夹g支撐。