結膜松弛癥球結膜成纖維細胞的原代培養及形態學觀察

麻 凱，劉 江，王亞卉，池華博文，項敏泓

作者單位：1(200062)中國上海市，上海中醫藥大學附屬普陀醫院眼科；2(200082)中國上海市，上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院眼科

0引言

結膜松弛癥(conjunctivochalasis，CCH)是臨床常見的眼表疾病，它是由于球結膜過度松弛和(或)下瞼緣張力升高，致使松弛的球結膜堆積在眼球與下瞼緣、內眥部、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學微環境異常，常伴有眼部干澀、異物感、溢淚等不適癥狀的一種年齡相關性眼病，影響患者的視覺和生活質量[1-3]。目前對結膜松弛癥的發病機制尚無明確定論，學者認為結膜松弛癥主要與結膜組織中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)兩者之間的失衡[4-5]、彈力纖維降解[6]、細胞衰老[7-9]等致病因素有關。成纖維細胞是疏松結締組織中的主要細胞，它不僅合成和分泌多種膠原蛋白和彈性蛋白，生成膠原纖維、網狀纖維和彈性纖維，還能分泌細胞外基質，是結膜組織中的重要成分之一[10-12]。自 De Falco等[13]報道體外成功提取人Tenon囊原代成纖維細胞以來，關于CCH的實驗研究進入了新的階段。但結膜成纖維細胞的原代提取及穩定傳代對于初學者而言仍較為棘手，失敗率相對較高，因此有必要建立一種更加完善和高效的培養方法。本研究旨在通過原代培養、純化及鑒定，觀察不同培養時期內CCH球結膜成纖維細胞的生長狀況及形態學變化，明確其生長周期，以期體外獲得穩定、一致的CCH球結膜成纖維細胞，從而為CCH發病機制的研究及尋求切實有效的治療方法搭建平臺。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標本收集結膜組織取自2021-03/06于上海中醫藥大學附屬普陀醫院眼科確診為CCH Ⅲ級[14]且符合手術指征的患者6例10眼，年齡65～83(平均74.35±1.57)歲，其中2例3眼合并糖尿病病史。納入患者均行詳細的眼部檢查和手術評估，排除青光眼、瞼緣炎、角結膜疾病(結膜炎、角膜炎、角結膜腫瘤等)、淚囊炎、淚道阻塞等其他眼部疾病，由同一術者采用經典的松弛結膜新月形切除術進行手術[15]。本研究已通過上海中醫藥大學附屬普陀醫院倫理委員會批準(No.PTEC-A-2021-14-1)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器DMEM細胞培養基(美國Hyclone公司)；青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、胎牛血清(美國Gibco公司)；波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(ab137332)(英國Abcom公司)；4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液(Triton X-100)、抗熒光淬滅封片液、山羊血清、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208)(上海碧云天生物科技有限公司)。CO2培養箱(Thermo公司)；超凈工作臺(蘇凈安泰公司)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；離心機(長沙湘儀公司)；酶聯免疫檢測儀(Bmg Labtech公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；高精確電子分析天平(德國Sartorious公司)。

1.2方法

1.2.1原代細胞培養無菌條件下取手術切除的松弛結膜組織，生理鹽水沖洗祛除血污，立即放入裝有完全培養基的1.5mL EP管中，低溫保存，采用組織塊貼壁法行原代球結膜成纖維細胞的分離培養。超凈工作臺中用眼科顯微剪修剪結膜組織約1mm×1mm大小，移入25cm2培養瓶中，將結膜組織平鋪于培養瓶底，待其微微干燥時，貼壁緩緩加入5mL含體積分數10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1%生長因子的DMEM完全培養液，勿使組織浮起。將培養瓶置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中靜置培養，每2～3d換液1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.2細胞傳代觀察CCH球結膜成纖維細胞生長特性，組織貼壁細胞生長到第8d時行消化、傳代。超凈工作臺中取出培養瓶，棄去培養基，加入1mL PBS洗滌，輕輕晃動，棄去PBS，再加入1mL 0.25%胰蛋白酶(EDTA)后靜置2min，倒置顯微鏡下觀察。當細胞質出現回縮，細胞變圓呈球形，細胞連接松散或有成片的細胞浮起時，表示消化時間適合，立即加入1mL完全培養基終止消化。離心管離心，見其底部乳白色細胞團塊，棄去上清液，加入1mL完全培養基，輕輕吹打制成均勻的細胞懸液，接種于6孔板，置于細胞培養箱中。每2～3d換液1次，待細胞鋪滿瓶底后再用同樣方法消化傳代。

1.2.3細胞形態學觀察倒置顯微鏡下定期觀察，記錄CCH結膜組織貼壁后第1、2、3、5、7、9、12、15d細胞的生長狀態及形態變化，注意防止污染，控制拍照觀察時間，以防離開培養箱時間過長進而影響細胞生長。

1.2.4細胞鑒定取第4～5代生長良好的CCH結膜成纖維細胞行胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，常規鋪板培養，待細胞完全貼壁時行免疫熒光染色。吸出原培養液，加入PBS溶液輕輕晃動，洗3遍，每次3min，室溫下加入4%多聚甲醛固定20min，PBS溶液洗滌，0.5% Triton X-100溶液破膜30min，5%山羊血清封閉，加入Vimentin單克隆抗體(1∶500)，4℃冰箱孵育過夜；次日PBS洗滌后，加入Alexa Fluor 488熒光標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)室溫避光孵育60min，PBS洗滌3次，DAPI染核5min，甘油明膠進行封片，熒光顯微鏡下拍照。

2結果

2.1CCH成纖維細胞的形態學觀察第1d，CCH結膜組織周圍有細胞逸出，表現為膠狀樣逸出帶，細胞較小，緊密排列，圓形或橢圓形，呈鋪路石樣分布，細胞輪廓不清晰；第2d，組織周圍膠狀樣細胞逸出帶較前明顯擴大，細胞融合成片并彼此連接成網狀，大小不一，排列不規則；第3d，細胞逸出帶較前進一步擴大，組織邊緣細胞生長較密集，細胞平行排列呈束帶狀、放射狀，周圍細胞分布相對疏松，部分細胞呈長梭形或多角形，可見偽足形成并向外逐漸伸展；第5d，細胞輪廓逐漸清晰，可見卵圓形細胞核，細胞核邊界清楚，細胞從組織周圍呈島狀生長爬出，島中心的細胞排列較緊密，多呈編織狀、魚群狀排列；周圍細胞排列相對疏松，相互交織成網狀，有較大的細胞間隙，長梭形細胞形態逐漸明顯；第7d，結膜組織透亮度高，細胞分布均勻，數目較多，胞體大小適中，細胞核明顯甚至雙核，細胞質清晰無空泡，細胞輪廓清晰、飽滿，形態規則；第9d，組織塊顏色加深，但未見黑化，細胞形態較模糊，細胞表面可見混濁、顆粒狀及深黃色的碎屑，其為細胞的分泌物或衰老的細胞器；第12d，組織塊邊緣部分黑化，組織周圍可見折光性較強的細胞碎片，細胞排列相對疏松，體積大而扁平，形狀不規則，細胞漿內可見空泡與顆粒，細胞透亮度降低；第15d，組織塊完全黑化，細胞老化，邊界模糊，細胞扁平呈鋪展狀生長，細胞漿內有大量顆粒狀物質和小泡產生，部分細胞開始從培養瓶底脫落，細胞之間出現較大空隙(圖1)。

圖1 不同時期CCH球結膜成纖維細胞形態學觀察 A、B：第1d，組織周圍有細胞爬出，細胞較小，緊密排列，呈鋪路石樣分布；C、D：第2d，細胞較前明顯增多，細胞融合成片并彼此連接成網狀；E、F：第3d，細胞較前進一步增多，組織邊緣細胞生長密集，周邊相對稀疏；G、H：第5d，細胞輪廓逐漸清晰，邊緣細胞有較大的間隙，長梭形細胞形態逐漸明顯；I、J：第7d，細胞分布均勻，數目較多，胞體大小適中，輪廓清晰，形態規則；K、L：第9d，組織塊顏色加深，細胞表面見混濁、顆粒狀及深黃色的碎屑堆積；M、N：第12d，組織塊邊緣部分黑化，胞體大而扁平，細胞漿內可見空泡與顆粒；O、P：第15d，組織塊完全黑化，部分細胞從培養瓶底脫落，細胞間出現較大空隙。

2.2傳代后CCH球結膜成纖維細胞形態學觀察傳代后細胞呈細長梭形、扁平星狀或多突的紡錘形，中間稍寬大，兩頭相對細小，有卵圓形的細胞核，伴向外伸出2～3個長短不同的細長突起，細胞密度均勻，排列規則，大小基本一致(圖2)。

球結膜成纖維細胞體外培養的主要方法有組織塊貼壁法和酶消化法[16-17]。酶消化法多選擇胰蛋白酶或胰蛋圖2 傳代后CCH球結膜成纖維細胞形態學觀察 A：第4代CCH球結膜成纖維細胞；B：第5代CCH球結膜成纖維細胞。

2.3CCH球結膜成纖維細胞免疫熒光鑒定對球結膜成纖維細胞標記性蛋白Vimentin進行免疫熒光染色鑒定，結果顯示球結膜成纖維細胞的細胞漿內可見綠色熒光，呈陽性反應，細胞核呈藍色熒光(圖3)。

圖3 CCH球結膜成纖維細胞標記性蛋白免疫熒光染色 A：Vimentin免疫熒光染色；B：細胞核DAPI染色；C：Merged。

2.4原代培養失敗的CCH球結膜成纖維細胞形態學表現部分原代培養的結膜組織貼壁良好但未見細胞從組織周圍爬出，選取原代培養失敗的不同時間點觀察組織形態學變化見圖4。

圖4 CCH球結膜成纖維細胞原代培養失敗的形態學觀察 A：第1d，組織貼壁，組織周圍未見細胞爬出；B：第3d，組織形態較前未見明顯變化，周圍未見細胞爬出；C：第7d，組織呈棕黃色，組織周圍未見細胞爬出；D：第15d，組織塊完全黑化，組織失去活性。

3討論

白酶與膠原酶聯合消化，但酶處理組織時間和酶濃度難以掌控，消化時間過長或酶濃度過高均可導致細胞活性下降，進而影響細胞的爬出與貼壁，且酶消化解離細胞的過程中容易導致細胞壁破損，使原代細胞狀態受到影響，對細胞生物學特性損傷較大，不利于細胞的傳代與后續實驗[18]。而組織塊貼壁法簡單易行，只需1～2mm2大小組織即可獲取大量穩定的成纖維原代細胞，同時又可避免消化酶對細胞的化學損傷，培養的細胞均質性與穩定性較好，也避免由于酶的長時間作用造成細胞損傷或遺傳特性改變。通過差速貼壁消化祛除結膜成纖維細胞中混合的結膜上皮細胞，傳至3代及以上即可得到純度相對較高且穩定的結膜成纖維細胞系[19-20]。既往研究主要確定了合適的細胞培養基及細胞鑒定方法，但對于原代成纖維細胞的傳代時間及不同時期的形態學觀察尚未見相關報道。

成纖維細胞原代培養過程中，因細胞增殖生長達到一定密度后，細胞之間會出現接觸抑制現象，細胞的生長、分裂速度會逐漸減慢甚至停止，如不及時進行消化和傳代，細胞會出現衰老甚至死亡。原代細胞消化傳代的頻率和時間間隔與接種細胞的種類、細胞生物學特性以及培養基性質等多種因素有關[21-22]。本研究通過組織塊貼壁法對CCH結膜成纖維細胞進行體外培養，發現CCH球結膜組織接種于培養瓶24h后即可見組織周圍有細胞逸出；第2～7d為球結膜成纖維細胞生長的對數期，此時可見細胞輪廓逐漸清晰，分布逐漸均勻，數目逐漸增多，中心生長的細胞排列相對緊密，呈放射狀、柵欄狀及魚群樣生長；周圍細胞排列較疏松，細胞呈紡錘形、扁平狀分布；第9～15d為細胞生長的平臺期，細胞增長緩慢，排列疏松，體積變大，形狀扁平，呈圓盤狀分布，部分細胞從培養瓶底部脫落，細胞之間出現較大空隙，且結膜組織透亮度逐漸降低，顏色加深，至組織塊黑化。與既往皮膚及肝臟成纖維細胞生長特性的研究相一致，符合成纖維細胞的生長規律[23-24]。本研究發現，組織貼壁后細胞平均生長時間為第8d時行消化傳代，傳代后細胞生長速度較快，形態規則，呈典型細長梭形，并伴有2～3個長短不一的突起，與目前所公認的成纖維細胞的形態學表現相符[25]。因此，根據上述球結膜成纖維細胞的生長周期及消化傳代后的生長狀況，原代細胞培養至第8d時行消化傳代，可獲得最佳的細胞狀態，且細胞數目相對較多，細胞的生物學特性能較穩定地傳遞下來，符合后續實驗的細胞數量要求。

Vimentin是成纖維細胞特異性高表達的一種蛋白，廣泛參與組織與細胞的修復和再生，包括細胞增殖、遷移、細胞外基質重塑及免疫反應等[26]。因此，Vimentin可作為成纖維細胞的一種標志性蛋白，并通過免疫熒光實驗技術進行成纖維細胞的鑒定[27-28]。Budel等[29]通過細胞免疫熒光檢測成纖維細胞標志性蛋白Vimentin染色呈綠色，DAPI染核呈藍色，證實為成纖維細胞。本研究通過免疫熒光染色發現CCH球結膜成纖維細胞標志性蛋白Vimentin染色結果為陽性，且符合成纖維細胞的形態學特征，證明本研究通過組織塊貼壁法所提的原代細胞為球結膜成纖維細胞。

然而，CCH球結膜成纖維細胞原代培養過程并非一帆風順，實驗中出現組織塊貼壁良好但始終未見細胞爬出。分析其失敗的原因可能有以下幾點：(1)患者年齡相對較大且合并多種基礎疾病，如糖尿病等，結膜組織活性相對較低；(2)取材后結膜組織塊未及時放入含培養基的EP管中低溫保存，暴露空氣中時間過長使組織失去活性；(3)平鋪組織操作時間過長，組織過于干燥，脫水而失去活性；(4)實驗操作不規范，結膜組織取材后未及時清洗致組織污染，影響細胞爬出；(5)未及時更換培養液，培養過程中產生的有害代謝性物質堆積阻礙細胞爬出。 成纖維細胞培養過程中經歷多次失敗，總結經驗得出：(1)取材盡量選取相對年輕且無基礎代謝性疾病(如糖尿病等)的患者；(2)取材后，無菌生理鹽水沖洗結膜組織以祛除血污，并立即放入含完全培養基的EP管中冷藏，否則組織活性降低影響成纖維細胞的爬出；(3)超凈工作臺中盡快完成結膜組織貼壁，勿使組織過于干燥，貼壁后緩緩加入完全培養基，以覆蓋組織為宜；(4) 貼壁后12h內盡量不要移動培養瓶，以免晃動引起組織塊漂浮，24h后可取出觀察并拍照記錄。如此操作，即可獲得均一、穩定的原代球結膜成纖維細胞。

綜上，本研究采用組織塊貼壁法分離提取原代CCH球結膜成纖維細胞，通過觀察成纖維細胞生長周期發現，當細胞爬出平均時間為第8d時行消化傳代最優，并通過差速貼壁法純化成纖維細胞可獲得穩定、一致的CCH球結膜成纖維細胞，為CCH發病機制的研究及尋找切實有效的治療方法創造了良好的實驗平臺。