利用DNA 條形碼技術對茶黑刺粉虱的鑒定與分析

張 莉，李 帥，張金峰，王威銳,3，孟澤洪

（1.貴州省農業科學院草業研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農業科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025）

茶黑刺粉虱（Aleurocanthus camelliaeKanmiya &Kasai）隸屬于半翅目（Hemiptera）粉虱科（Aleyrodidae）粉虱亞科（Aleyrodinae）刺粉虱屬（Aleurocanthus），是茶園里最常見的粉虱類害蟲[1]。茶黑刺粉虱主要通過吸食葉片汁液、誘發煤煙病造成危害，從而影響樹勢，同時生產季節成蟲的活動也會干擾茶農的勞作[2]。寄主為茶的茶黑刺粉虱（A. camelliae）與寄主為柑橘等植物的橘黑刺粉虱（A. spiniferus）的分類尚存在一定的爭論。早些年，一般認為為害茶樹的黑刺粉虱即橘黑刺粉虱[3-4]；但基于生態學、形態學和分子進化與系統發育學的研究結果表明，茶黑刺粉虱應為獨立的物種[5]。目前，茶黑刺粉虱和橘黑刺粉虱的線粒體基因組均已公布[6-7]。但由于茶黑刺粉虱在很長一段時間內被視為與橘黑刺粉虱同種，因此現已知的這2種粉虱的分子數據存在一定的混亂，需要進行全面細致的區分。

DNA 條形碼技術（DNA Barcoding）是由加拿大的Hebert 博士首次提出的。該技術基于線粒體DNA 細胞色素C 氧化酶亞基I（mitochomdrail DNA cytochrome coxidase subunit I, mtDNACOI）基因進行核苷酸序列分析，可利用mtDNACOI中一段特定區域（約658 bp）鑒定不同的物種[8]。目前，該技術已在諸多昆蟲中得以驗證與應用[9-10]。

茶樹主要害蟲茶黑刺粉虱的mtDNACOI基因數據極少且均不是目前鑒定上通用的DNA 條形碼特定標準區域序列片段[5]，如此不便于種類間的橫向比較，因此，筆者擬通過試驗獲取茶黑刺粉虱DNA 條形碼特定標準區域（658 bp）的分子序列數據，并進行遺傳距離及系統發育分析，以期為進一步掌握茶黑刺粉虱DNA 條形碼以及分子鑒定提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲源采集信息如表1 所示，所有樣本均采自茶葉寄主，將采集到的粉虱置于裝有無水乙醇的2 mL 凍存管中，冷凍于-20℃冰箱中保存備用。

表1 試驗樣品信息

1.2 DNA 提取及PCR 擴增

采用Qiagen DNEasy Tissue kit 試劑盒提取單頭蟲體的DNA。蟲體經研磨破碎后，按照說明書進行操作，提取的DNA 用1%瓊脂糖電泳進行檢測，再采用通用引物LCO1490/ HCO2198[11]對其mtDNACOI基因序列特定區域片段[8]進行PCR 擴增。PCR 擴增體系總體積為50 μL，包括10×PCR 緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2.5 mmol/L 的dNTP 混合液4 μL，10 μmol/L 的上下游引物各1.5 μL，5 U/μL 的TaKaRa TaqDNA 聚合酶0.3 μL 和DNA 模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR 反應程序為：94℃預變性4 min；94℃30 s，Tm 40 s，72℃ 30 s，34 個循環；72℃ 10 min；4℃保存。PCR 產物經電泳檢測后送上海立菲生物技術有限公司及北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。

1.3 數據分析

序列的拼接使用DNAMAN 軟件進行，結合測序峰值圖進行正反鏈的拼接校對，將拼接好的序列在NCBI 網站上利用BLAST 程序進行序列同源性搜索，采用CLUSTALX2.0 進行序列比對。比對后的結果采用Mega6 軟件[12]進行序列組成分析、遺傳距離比較和NJ 樹構建。下載已知的黑刺粉虱線粒體基因組數據KJ437166 和KU761949，并利用BIOEDIT 軟件截取獲得的同源DNA 條形碼特定區域658 bp 片段序列進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 DNA 條形碼特定區域片段的序列組成分析

如表1 所示，序列拼接后去掉兩端引物序列，長度為658 bp，GeneBank 登錄號分別為ON534214、ON534215、ON534319、ON534320、ON548918、ON548917。序列堿基組成特征為：T（42.8%）、C（13.7%）、A（22.7%）、G（20.8%），A+T 含量明顯高于G+C 的含量。將獲得的序列在NCBI 數據庫中進行BLAST 同源性比對，結果顯示，貴州湄潭（GH81）、獨山（08、09）以及山東泰安（EM13）的樣本序列完全一致，與KJ437166 序列對應片段高度吻合，僅在1 個堿基位點上有所差異，序列相似度為99.85%；貴州貴陽（HCNK-1D1、HCNK-1D2）的茶黑刺粉虱樣本序列僅為一種單倍型，該序列同KU761949 對應片段的序列高度吻合，僅在2 個堿基位點上有所差異，序列相似度為99.70%。

2.2 DNA 條形碼特定區域片段的比較分析

將試驗獲得的茶黑刺粉虱DNA 條形碼特定區域片段序列與在GenBank 上下載的已知黑刺粉虱對應的同源片段序列KJ437166 和KU761949 基于Kimura 2-parameter 參數進行遺傳距離分析，選擇與茶黑刺粉虱近緣的刺桐粉虱Tetraleurodes acaciae（Quaintance）（GenBank 登錄號：AY521262）[6]作為外群，結果見表2，茶黑刺粉虱DNA 條形碼特定標準區域的序列遺傳距離為0～8.7%，與外群刺桐粉虱遺傳距離為28.9%～29.8%，與外群種的遺傳距離遠大于茶黑刺粉虱種內遺傳距離。利用鄰接法（Neighbor joining method，NJ 法）構建系統發育樹，系統樹各分支的置信度（boostrap）均進行1 000 次的重復檢驗，結果如圖1 所示，茶黑刺粉虱與外群種刺桐粉虱明顯屬于不同的分支，同時6 個茶黑刺粉虱樣本明顯分出2 大分支，其中貴州湄潭（GH81）、獨山（08、09）和山東泰安（EM13）以及KJ437166 聚為一分支，貴州貴陽樣本（HCNK-1D1、HCNK-1D2）和KU761949 聚為另一分支。

表2 遺傳距離分析

圖1 基于mtDNA COI 基因DNA 條形碼序列構建的茶黑刺粉虱NJ 樹

3 討 論

3.1 茶黑刺粉虱的COI 基因分化

COI基因在昆蟲物種鑒定分類上應用極為廣泛，其中關于茶黑刺粉虱A. camelliae COI基因的研究也有相關報道[5,13-15]，例如Chen 等[6]測定的線粒體基因組全長序列KU761949。但不同研究者間分析所用的COI序列片段不盡相同，并且有些研究未將序列信息上傳至GenBank[13,15]。目前，GenBank 數據庫中除去線粒體基因組全長序列外，其他已知的COI基因序列僅11 條，并且與DNA 條形碼標準序列片段重合區域極窄，不利于各粉虱種類間的橫向比較。該研究提供了6 個茶黑刺粉虱mtDNACOI基因特定的DNA 條形碼標準區域片段序列，并將序列信息上傳至GenBank，登錄號分別為ON534214、ON534215、ON534319、ON534320、ON548917、ON548918。

學者們關于茶黑刺粉虱COI基因分化程度的研究結果也有所不同，這與研究限定的地理范圍有一定的關系。Kanmiya 等[5]選取了COI基因中一段759 bp的序列進行茶黑刺粉虱遺傳分化研究，結果發現茶黑刺粉虱在日本7 個地理種群間序列相似度達99.74%，雖具有2 種單倍型，但單倍型間僅相距2 個堿基差異。胡雅輝等[13]選取了COI基因660 bp 的序列片段進行茶園黑刺粉虱遺傳分化研究，發現湖南茶園內不同地理種群黑刺粉虱遺傳距離為0～5.3%。Uesugi 等[14]對來自中國和日本的茶黑刺粉虱進行分子序列分析，發現2 國的茶黑刺粉虱已經明顯分化為3 個分支。該研究基于COI基因特定的DNA 條形碼標準區域658 bp的片段序列對6 種不同來源的茶黑刺粉虱進行的遺傳距離分析，發現它們之間的遺傳距離為0～8.7%，并且分化為2 大分支，其中貴州湄潭（GH81）、獨山（08、09）和山東泰安（EM13）以及KJ437166 聚為一分支，貴州貴陽樣本（HCNK-1D1、HCNK-1D2）和KU761949 聚為另一分支。

3.2 茶黑刺粉虱和橘黑刺粉虱的分類地位

Kanmiya 等[5]基于生態學、形態學和分子系統發育研究分析提出茶黑刺粉虱A. camelliae應為單獨成立的物種。胡雅輝等[13]研究發現，柑橘黑刺粉虱種群和茶園黑刺粉虱種群的遺傳距離明顯高于柑橘黑刺粉虱不同地理種群間遺傳距離和茶園黑刺粉虱不同地理種群間的遺傳距離，并推測柑橘黑刺粉虱和茶園黑刺粉虱可能屬于黑刺粉虱的不同生物型或不同種。陳瑤等[15]結合分子鑒定和形態觀察發現，貴州省12 個茶園的黑刺粉虱為茶黑刺粉虱A. camelliae，并與橘黑刺粉虱A. spiniferus屬于不同分支（種）。Uesugi 等[14]的研究也表明，在中國和日本，以柑橘為寄主的黑刺粉虱和以茶為寄主的黑刺粉虱應為不同種。該研究基于COI基因中DNA 條形碼區域片段構建了系統樹，發現茶黑刺粉虱不同地理種群可單獨作為一分支，與外群刺桐粉虱分屬不同類群。

Uesugi 等[14]利用COI基因674 bp 序列片段分析得出，茶黑刺粉虱分化為單倍型B1、B2 和單倍型群B3，采自我國安徽（宣城）、浙江（金華、寧德、溫州）、福建（福安）、廣東（英德）、江西（青原）、湖南（長沙）、四川（成都）的茶黑刺粉虱均為B1 單倍型，來自重慶永川的種群均為B2 單倍型，而檢疫截獲的來自中國山茶科植物的茶黑刺粉虱既有B1 單倍型，也有B3單倍型；采自日本的茶黑刺粉虱均為B1 單倍型，這一結果同Kanmiya 等[5]建立茶黑刺粉虱A. camelliae這一新種時的數據一致。Chen 等[6]發布了采自重慶永川的茶黑刺粉虱的線粒體基因組序列（登錄號為KU761949），比對后發現，其與Uesugi 等[14]提出的B2 單倍型結果一致。Chen 等[7]發布了采自浙江杭州的黑刺粉虱線粒體基因組序列（登錄號為KJ437166），但研究中并未提及其寄主，只是給出了鑒定種名為橘黑刺粉虱A. spiniferus；將其與Uesugi 等[14]提出的3 種單倍型數據比對后發現，該序列與B1 單倍型結果一致。而筆者的研究也發現，KJ437166 種群可能是來源于茶葉寄主，應該鑒定為茶黑刺粉虱B1 單倍型，而不是橘黑刺粉虱A. spiniferus，陳瑤等[15]也得出了類似的結論。然而，Uesugi 等[14]又表示，從系統發育樹的結果來看，不同的單倍型（群）分支間可能已經達到不同種的級別。在該研究中，貴州湄潭（GH81）、獨山（08、09）和山東泰安（EM13）的樣本屬于B1 單倍型（群），貴州貴陽樣本（HCNK-1D1、HCNK-1D2）則屬于B2 單倍型（群），這是除茶黑刺粉虱重慶永川種群之外在其他地區初次發現B2 單倍型，2 種單倍型（群）分化明顯（遺傳距離8.2%～8.7%），但是否已經達到不同種的水平，尚需要結合生態學或更多的序列數據進一步闡明。

4 結 論

研究利用DNA 條形碼技術成功獲取了來源于貴州獨山、貴陽、湄潭以及山東泰安茶園的6 個茶黑 刺 粉 虱 樣 本 的mt DNACOI基 因DNA 條 形 碼 特定的標準區域序列片段，登錄號分別為ON534214、ON534215、ON534319、ON534320、ON548917、ON548918，通過序列比對發現，茶黑刺粉虱個體間的遺傳距離（0～8.7%）遠小于與外群刺桐粉虱遺傳距離（28.9%～29.8%），證明DNA 條形碼技術應用有效；系統發育樹結果顯示，來源于不同地區的茶黑刺粉虱明顯分化為2 大分支，分別為貴州湄潭、獨山和山東泰安分支以及貴州貴陽分支，其結果可支持茶黑刺粉虱的單系性結論，同時2 大分支分化明顯，尚可能存在隱存種。