高效液相色譜法測定復方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量

姚路路，程嬋嬋，張 聰，魏 軻，楊會鮮，周德剛

(洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471000)

復方非潑羅尼滴劑的有效成分為非潑羅尼和甲氧普烯，非潑羅尼作用于跳蚤成蟲和蜱，甲氧普烯作用于跳蚤卵和幼蟲，二者連用發揮協同增效作用，可用于驅殺犬體表的成年跳蚤，跳蚤卵、幼蟲和蜱，文獻[1-4]報道，復方非潑羅尼滴劑可有效治療和預防犬、貓蜱蟲和跳蚤感染及室內環境中跳蚤清除，單次使用可提供長達30 d的保護。復方非潑羅尼滴劑中非潑羅尼易氧化，處方中添加叔丁基對羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)為抗氧劑，可有效抑制非潑羅尼的氧化降解，但復方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量測定方法還缺少相關的檢驗標準，文獻中對BHA、BHT的含量測定有很多報道[5-16]，但是，針對復方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量檢測未見有相關報道。由于本品為復方，且BHA、BHT的添加量比較低(分別為0.02%、0.01%，v/w)，采用文獻方法檢測干擾較大，為控制制劑質量，本研究擬建立高效液相色譜法(HPLC)測定復方非潑羅尼滴劑中BHA和BHT的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Alliance e2695型高效液相色譜儀(配有2998型PDA檢測器和Empower 3工作站，美國Waters公司)；AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.1.2 試藥 二丁基羥基甲苯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：190065-201602，含量：99.9%)；叔丁基對羥基茴香醚對照品(Dr. Ehrenstorfer GmbH，批號：G129943，含量：99.4%)；復方非潑羅尼滴劑(洛陽惠中獸藥有限公司，規格：1.34 mL/管，批號：20180401，20180402，20180403)；甲醇(Thermo Fisher公司，HPLC級)；乙腈(Thermo Fisher公司，HPLC級)；冰醋酸(天津市科密歐化學試劑開發中心，色譜純)；水為超純水。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 × 4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈-甲醇-水(47∶21∶32)，混合前在水中加入1%冰醋酸；流動相B：乙腈；采用線性梯度洗脫(0 min，100% A；7 min，100% A；7.1 min，40% A；20 min，40% A；20.1 min，15% A；25 min，15% A；25.1 min，100%A；30 min，100%A)，流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：285 nm；進樣體積：20 μL。

1.2.2 溶液的制備 BHA對照品貯備液的制備：取BHA對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成0.1 mg/mL的溶液，搖勻，即得。BHT對照品貯備液的制備：取BHT對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成0.05 mg/mL的溶液，搖勻，即得。BHA、BHT對照品溶液的制備：精密量取BHA、BHT對照品貯備液各2 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。BHA和BHT混合對照品溶液的制備：精密量取BHA、BHT對照品儲備液各2 mL，置同一20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。陰性樣品溶液的制備：按復方非潑羅尼滴劑處方配制不加BHA、BHT的陰性樣品，取約1.0 g，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備：取復方非潑羅尼滴劑約1.0 g，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 專屬性 按1.2.1項下色譜條件，分別精密吸取空白溶劑、1.2.2項下BHA對照品溶液、BHT對照品溶液、BHA和BHT混合對照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，對色譜圖進行比對。

1.2.4 線性 分別精密吸取1.2.2項下BHA、BHT對照品貯備液1.0、2.0、2.0、3.0、3.0 mL，分別置同一20、25、20、25、20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到一系列濃度的BHA、BHT混合對照品溶液。分別精密吸取20 μL，從低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以溶液濃度(C，mg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，并求出回歸方程。

1.2.5 檢測限與定量限 分別取1.2.2項下BHA、BHT對照品溶液，加甲醇逐步稀釋后進樣20 μL，以信噪比S/N=3的濃度作為檢測限，以信噪比S/N=10的濃度作為定量限。

1.2.6 進樣精密度 取1.2.2項下BHA和BHT混合對照品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，重復進樣6針，記錄峰面積，計算其峰面積相對標準偏差(RSD)。

1.2.7 重復性 按照1.2.2項下方法制備供試品溶液，分別制備6份，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算BHA、BHT含量，計算RSD。

1.2.8 中間精密度 另一名分析人員在不同的日期使用不同的儀器獨立建立系統，按照1.2.2項下方法重新制備6份供試品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算BHA、BHT含量，計算RSD。

1.2.9 溶液穩定性 按照1.2.2項下方法制備BHA、BHT對照品溶液和供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，記錄色譜圖，計算其峰面積RSD。

1.2.10 加樣回收率 取復方非潑羅尼滴劑(批號：20180401)0.5 g，精密稱定，置20 mL量瓶中，平行9份，3個一組，分別精密加入BHA、BHT對照品儲備液(BHA：0.05 mg/mL，BHT：0.025 mg/mL)1.0、2.0、3.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。

1.2.11 耐用性試驗 取1.2.2項下對照品溶液和供試品溶液，通過改變柱溫(25、30、35 ℃)、流動相比例(±1%)、流速(0.8、0.9、1.0 mL/min)以及使用同一品牌不同型號的色譜柱及不同品牌的色譜柱(Agilent Zorbax SB-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，序列號：USCL079103、USCL083984；Waters SunFire C18 序列號：01753614013846；Kromasil 100-5-C18 序列號：E168478)考察對BHA、BHT含量測定的影響。

1.2.12 樣品測定 取本品三批，按1.2.2項下方法分別制備供試品溶液及對照品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算樣品中BHA、BHT的含量。

2 結果與分析

2.1 專屬性 結果見圖1，在該色譜條件下，空白溶劑中溶劑峰及陰性樣品不干擾主峰含量測定。

A-空白溶劑 B-BHA、BHT混合對照品溶液 C-陰性樣品溶液 D-供試品溶液A- Diluent B-Reference substance of BHA and BHT C- Negative control D- Test sample

2.2 線性 以溶液濃度(C，mg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，并求出回歸方程。結果表明BHA在5.13～ 15.39 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為y= 21755x+ 3853.5，相關系數為0.9996，BHT在2.56 ～ 7.66 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為y=8620.6x+2531，相關系數為0.9990。

2.3 檢測限與定量限 以信噪比S/N=3的濃度作為檢測限，測得BHA、BHT的檢測限分別為0.08 μg/mL和0.19 μg/mL；以信噪比S/N=10的濃度作為定量限，測得BHA、BHT的定量限分別為0.31 μg/mL和0.77 μg/mL。

2.4 進樣精密度 對進樣精密度試驗記錄的色譜圖進行處理，計算6次進樣BHA、BHT保留時間的RSD分別為0.1%、0.1%，峰面積的RSD分別為0.3%、0.8%，表明進樣精密度良好。

2.5 重復性 對重復性試驗記錄的色譜圖進行處理，按外標法以峰面積計算BHA、BHT含量，6次測定結果BHA含量RSD為0.4%，BHT含量RSD為1.0%，表明方法重復性良好。

2.6 中間精密度 對中間精密度試驗記錄的色譜圖進行處理，結果2人12次測定結果BHA含量RSD為0.6%，BHT含量RSD為1.4%，表明方法中間精密度良好。

2.7 溶液穩定性 對照品溶液放置24 h，BHA、BHT峰面積RSD分別為1.0%、0.7%，供試品溶液放置24 h，BHA、BHT峰面積RSD分別為0.5%、1.0%，表明對照品溶液及供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率 對加樣回收率試驗記錄的色譜圖進行處理，按外標法計算BHA、BHT含量，計算回收率，結果BHA平均回收率為98.5%，RSD為1.8%，BHT平均回收率為99.9%，RSD為2.8%，說明方法準確度良好，結果見表1～表2。

表1 BHA加樣回收率試驗結果(n=9)Tab 1 The result of sample recovery rate of BHA(n=9)

表2 BHT加樣回收率試驗結果(n=9)Tab 2 The result of sample recovery rate of BHT(n=9)

2.9 耐用性 試驗結果見表3，結果表明，當方法中流速、柱溫、流動相比例發生較小變化時，對BHA、BHT的含量測定影響均較小，不同批次色譜柱對BHA、BHT的含量影響較小，使用不同品牌色譜柱時，對BHT的含量影響較大，BHT峰與相鄰雜質峰未達到基線分離，受雜質峰影響，導致其含量偏差較大，因此，規定本品采用Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進行測定。

表3 耐用性試驗結果Tab 3 The result of durability test

2.10 樣品測定 按外標法計算三批樣品中BHA、BHT的含量，測定結果見表4。

表4 復方非潑羅尼滴劑抗氧劑測定結果Tab 2 Determination Results of BHA and BHT inCompound Fipronil Spot-On Solutions

3 討論與結論

3.1 檢測波長的選擇 采用PDA檢測器，將BHA、BHT對照品溶液在190～400 nm范圍內進行紫外掃描，Empower 3數據工作站分析，取每個峰的紫外吸收光譜圖，記錄每個峰的主要最大吸收波長，結果顯示BHA最大吸收波長為290.3 nm，BHT最大吸收波長為277.2 nm，研究發現，波長設定為280 nm時，BHT峰左右兩側各有一雜質峰，多次調整色譜條件均不能實現基線分離，方法耐用性差，經分析發現BHT附近雜質最大吸收波長在266.5～277.2 nm，將檢測波長設定為285 nm后，雜質干擾有明顯改善，故將檢測波長設定為285 nm。

3.2 色譜條件的建立 由于復方非潑羅尼滴劑中BHA、BHT的添加量比較低(分別為0.02%、0.01%，v/w)，為有效檢出抗氧劑的含量，供試品溶液的配制濃度較高，非潑羅尼、甲氧普烯及雜質峰均有很強的響應，檢測極易有干擾，本研究發現國內外僅有與BHA、BHT測定相關的文獻[5-16]，且多為包材及植物油中的抗氧劑檢測，僅有少數用于藥品中的抗氧劑檢測，未發現有復方非潑羅尼滴劑中BHA、BHT檢測方法相關的文獻，本試驗嘗試了文獻中甲醇-水系統、乙腈-水系統、甲醇-甲酸-水系統、甲醇-乙酸-水系統、乙腈-乙酸-水系統、乙腈-乙酸銨-水系統等多種流動相系統，結果發現在以上這些色譜條件下，其他色譜峰對BHA、BHT峰均有嚴重干擾，后參照2011年進口再注冊獸藥“復方非潑羅尼滴劑(犬用)”質量標準中有關物質色譜條件乙腈-甲醇-1%醋酸溶液系統，結果發現BHA、BHT峰型相對較好，干擾較小，在此基礎上對流動相比例、梯度洗脫程序進行不斷的優化，同時比較了不同流速的影響，將流速調整為0.9 mL/min，分離效果相對較好，經過多次調整，最終采用1.2.1項下色譜條件BHA、BHT峰型較好，與相鄰峰之間分離度良好，因此，最終確定1.2.1項下色譜條件作為抗氧劑檢查用色譜條件。

采用文獻所報道的方法均存在干擾，不適用于本品中抗氧劑的含量檢測，本文所建立的復方非潑羅尼滴劑中的抗氧劑含量測定方法，在BHA、BHT相同保留時間處，陰性樣品及空白稀釋液均無色譜峰出現，BHA、BHT的檢測限可達0.08 μg/mL和0.19 μg/mL；定量限可達0.31 μg/mL和0.77 μg/mL，說明所建立的方法專屬性好、靈敏度高，加樣回收率及耐用性結果表明所建立的方法準確度高、耐用性好，能準確檢測出復方非潑羅尼滴劑中抗氧劑的含量。