甜瓜CmABCG8基因的表達特性分析

洪天澍 海英 恩和巴雅爾 高峰

（1.內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特 010022；2.內蒙古興安盟科爾沁右翼前旗第一中學，興安盟 137400）

三磷酸腺苷結合盒（ATP-binding cassette）蛋白又稱ABC轉運蛋白，是一個廣泛存在、種類繁多的超家族，它以ATP水解酶為能源，促進多種底物的跨膜轉運，大多數ABC基因編碼的膜結合蛋白直接參與多種分子的跨膜運輸［1］，植物ABC蛋白家族由3種結構類型組成，其包括完全轉運蛋白、半轉運蛋白、可溶性轉運蛋白。完全轉運蛋白由兩個跨膜結構域（transmembrane domains，TMD）和兩個核苷酸結合結構域（nucleotide-binding domains，NBD）組成，半轉運蛋白由一個TMD和一個NBD組成，通過形成同二聚體、異二聚體或多聚體來行使功能。第三類型的轉運蛋白沒有TMD，但有兩個NBD，這類蛋白稱為可溶蛋白類型［2］，它們都有一個胞質的核苷酸結合域（NBD）。近幾年的研究發現，植物ABC蛋白不僅參與了激素、脂質、金屬、次生代謝物和外源物質的運輸，而且還參與了植物與病原菌的相互作用和離子通道的調節［3］。在高等植物中，ABC蛋白在系統發育上被組織成8個簇，即ABCAABCI亞家族（植物中不存在ABCH）［4］。ABCG轉運蛋白是植物ABC轉運蛋白家族中最大的亞家族，在擬南芥和水稻中均有40多個成員［5］，其結構為NBD-TMD，這種結構只有經過二聚才能成為功能型轉運體，ABCG亞家族可分為半分子式轉運蛋白和全分子式轉運蛋白兩類，并且功能多樣化。與其他類型生物相比，ABCG亞家族在植物中的比例要大得多。其原因在于植物的固著生活方式，例如需要輸出有毒化合物和植物產生的種類繁多的次生代謝物，這些次生代謝物通常需要跨膜運輸到它們的作用部位［6］。研究得知，植物ABCG轉運蛋白亞家族成員具有參與植物激素傳遞（包括生長素、細胞分裂素和獨角金內酯等）功能［7］；ABCG全分子式轉運蛋白參與植物體內抗重金屬、抗病原菌、生長素應答、轉運信號分子等功能［8-10］，而ABCG半分子式轉運蛋白參與植物體內卡那霉素抗性、脂類平衡、脫落酸轉運等功能［11-13］。表皮細胞的形成與角質層的合成對植物果實的生長具有重要作用［14］，有研究報道，AtABCG11參與擬南芥葉片和莖部角質形成，AtABCG13參與擬南芥花組織的角質形成［15］，水稻中OsABCG26和OsABCG15通過絨氈層細胞轉運脂類。在人體中HsABCG5與HsABCG8共同作用可以促進多種底物跨細胞膜的轉運［16］。

甜瓜（Cucumis melo L.）是廣泛栽培的重要的經濟農作物。其果實香甜，營養豐富，富含糖、淀粉、少量蛋白質、維生素、礦物質等。隨著對甜瓜研究的深入，甜瓜已經成為闡明肉質果實發育成熟分子機理的植物。近年來，甜瓜轉基因工程技術的廣泛運用，使得甜瓜具有抗病、抗逆、耐鹽堿等優良特性。目前，ABC轉運蛋白家族基因的功能在甜瓜中研究較少，甜瓜中ABCG轉運蛋白的研究還尚未可知。因此，對于ABCG轉運蛋白在甜瓜中的功能及作用還需要進一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甜瓜品種‘河套密瓜’，由本實驗室 保 存。1/2 MS培 養 基、MnCl2、CuSO4、FeSO4、細胞分裂素（CTK）、油菜素內酯（BR）、過氧化氫（H2O2）等試劑購自呼和浩特洪陽生物技術有限公司，TRIzol試劑購自北京全式金生物技術有限公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、熒光定量PCR試劑 SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜CmABCG8基因的系統進化樹構建 通過NCBI網站和MELONOMICS（https://www.melonomics.net/）數據庫下載擬南芥、番茄、甜瓜、黃瓜4個物種的ABCG家族基因序列，通過MEGA7軟件進行多序列比對，用Neighbor joining的方法做進化樹分析。

1.2.2 數據庫中甜瓜ABCG家族表達量分析 通過CuGenDB（http://cucurbitgenomics.org/）數據庫得到甜瓜ABCG亞家族成員在根、果實、葉、雄蕊、雌蕊的表達量，使用TBtools軟件做成熱圖，對其進行分析。

1.2.3 甜瓜CmABCG8基因的互作蛋白網絡圖構建 通過STRING（https://cn.string-db.org/）網站分析CmABCG8氨基酸序列，得到與其互作的蛋白數據導出后用Cytoscape軟件做圖。

1.2.4 甜瓜種植及處理 甜瓜種植于內蒙古自治區巴彥淖爾市磴口縣，在甜瓜盛花期使用人工自交授粉，標記授粉起始日期。果實的采摘從授粉后開始，取所摘果實的中果皮組織，速凍于液氮中保存，每隔5 d采一次，直到授粉后的50 d為止；當生長期到40 d時取根、莖、葉和花4種組織，速凍于液氮中保存；選取籽粒飽滿、大小均一的甜瓜種子種植于營養土中，待其長出第2片真葉后，進行不同的處理。其中，取甜瓜根部，用于金屬離子處理。離 子 濃 度 分 別 為 Fe2+、Cu2+：0、50、100 和200 mg/L［17-18］，Mn2+：0、0.272、1.36 和 6.8 mg/L［19-20］；取甜瓜幼葉，用于過氧化氫（H2O2）、植物激素細胞分裂素（CTK）和油菜素內酯（BR）的 處 理，3種 處 理 濃 度 均 為 ：0、0.4、4和40 μmol/L［21］。具體方法如下，以細胞分裂素為例：配置400 mL的1/2 MS液體培養基，分裝在4個三角瓶中，其中3個分別加入不同濃度的細胞分裂素（0.4、4和40 μmol/L），第4個不加，作為對照。將甜瓜幼葉或根分別用70%乙醇和0.1%的HgCl2浸泡，浸泡前后均使用無菌水沖洗、晾干。將幼葉和根分別加入對應濃度的1/2 MS液體培養基中進行室溫培養，培養時間分別為2 h和36 h，無菌水沖洗、晾干，使用液氮速凍保存于-80℃超低溫冰箱中。以上每種材料均設3個生物學重復。

1.2.5 RNA的提取 采用TRIzol法提取已保存材料的總RNA，將材料在液氮中冷卻并迅速研磨至粉末狀，每50 mg液氮研磨的嫩葉組織加入1 mL TRIzol反復吹打，室溫放置5 min后，加入200 μL的氯仿強烈震蕩后，室溫條件下靜置2-3 min，4℃ 12 000 r/min低溫離心15 min，移取上清液至新的離心管中加入等量的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10 min，再低溫離心10 min棄去上清液，1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀，低溫離心3 min棄上清，使用去RNase的滅菌水溶解沉淀，即得到甜瓜總RNA。經瓊脂糖凝膠電泳檢測和超微量紫外分光光度計檢測后，將提取的RNA置于-80℃冰箱中儲存。

1.2.6 cDNA的合成 以上述提取的總RNA作為模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進行cDNA合成。反應體系共包括反應1和反應2兩個部分。反應1主要進行RNA的變性，反應2進行cDNA的合成。反應 1體系為：取 2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、1 μg總 RNA，用去 RNase水補平至10 μL，混合均勻。反應程序為：42℃，2 min，4℃暫時保存。反應2體系為：1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×Prime Script Buffer、4 μL RNase Free dH2O 與 10 μL 反 應1混合液混合均勻。反應程序為：42℃，15 min；85℃，5 s，冰上冷卻。

1.2.7 熒光定量PCR 利用Mastercycler?ep實時熒光定量RCR儀，對樣品進行表達特性分析。以合成的cDNA第一條鏈為模板，PCR反應體系共25 μL，其中 12.5 μL SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ，5 μmol/L的上下游引物各 2 μL，cDNA 5 μL，RNaseFree dH2O 3.5 μL。反應過程為95℃預變性10 s；95℃變性5 s；60℃退火20 s；65℃延伸10 s，共40個循環結束；同時做溶解曲線分析，95℃，10 s。使用甜瓜GADPH基因作為內參。

GADPH內參引物序列為（上游引物：5'-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3'，下游引物：5'-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3'）；CmABCG8基因引物序列為（上游引物：5'-AAACATCGGAATGGACAAAGCC-3'，下游引物：5'-ACGAGGACGAAGTAGGCGAAAG-3'）。

2 結果

2.1 CmABCG8的系統進化樹的分析

選取擬南芥、番茄、甜瓜、黃瓜中ABCG亞家族成員的氨基酸序列構建系統進化樹，結果如圖1所 示，CmABCG8 與 CsABCG23、CsABCG5、CsABCG10、SlABCG19在同一支中，其中CmABCG8和CsABCG23的一致性最高。

圖1 CmABCG8和擬南芥、番茄、黃瓜、甜瓜中ABCG基因的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of ABCG genes in CmABCG8 and Arabidopsis thaliana，tomato（Solanum lycopersicum），cucumber（Cucumis sativus L.）and melon（Cucumis melo L.）

2.2 甜瓜ABCG家族基因表達譜熱圖

通過TBtools軟件將甜瓜ABCG亞家族在甜瓜根、莖、葉、雄蕊、雌蕊中的表達量做成熱圖（圖2），可明顯的看出甜瓜ABCG亞家族整體在雄蕊中表達量偏高，在果實中整體表達量偏低。CmABCG8在雌蕊中表達最高，在根、雄蕊、葉中表達量較高，在果實中表達量不明顯。

圖2 甜瓜ABCG基因家族在不同組織中的表達Fig.2 Expression of ABCG gene family in the different tissues of melon

2.3 甜瓜CmABCG8蛋白互作網絡圖

通過STRING網站對CmABCG8有相互作用的蛋白質進行預測，發現CmABCD1、Pattellin-4、Ferredoxin-nitrite、Thioredoxin H2、DHN1、Tc-0109、Mildew resistance6、Sulfate transporter3.5、LOC103482955、NRT1等10個 蛋 白 直 接 與CmABCG8存在相互作用關系（圖3），結合Cytoscape軟件清晰標注發生互作的蛋白名稱。

圖3 甜瓜CmABCG8的蛋白質互作網絡Fig.3 Protein interaction network of CmABCG8 in melon

2.4 果實不同發育時期CmABCG8基因的表達特性分析

在果實不同發育時期，表達量如圖4所示，以0 DAP的表達量設為1，CmABCG8基因在10 DAP的表達量達到峰值，增加了1.50倍，其他時期均呈現出下降的趨勢，到35 DAP時表達量達到最低，是10 DAP時表達量的1/35 000，35 DAP后，表達量又開始輕微上升，但極其不明顯。

圖4 甜瓜果實不同發育時期CmABCG8基因的相對表達量Fig.4 Relative expressions of CmABCG8 gene in melon fruit at different development stages

2.5 甜瓜不同組織中CmABCG8基因的表達特性分析

在甜瓜不同組織中，以根的表達量設為1，莖、葉、花的表達量都呈現上升的趨勢（圖5），基因在葉的表達量最高，為根的26倍。方差分析結果顯示，與根相比，莖、葉的表達量差異達到極顯著水平，與葉相比，莖和花的表達量差異均達極顯著水平。

圖5 甜瓜不同組織中CmABCG8基因的相對表達量Fig.5 Relative expressions of CmABCG8 gene in the different tissues of melon

2.6 植物激素和H2O2處理后CmABCG8基因的表達特性分析

不同濃度的CTK、BR和H2O2處理，均會誘導甜瓜葉片中CmABCG8基因的表達。處理濃度為4 μmol/L時，該基因在CTK和H2O2處理組中的表達量達到最大值；處理濃度為40 μmol/L時，在BR處理中該基因表達量達最高值（圖6）。

圖6 植物激素和H2O2處理對CmABCG8基因表達特性的影響Fig.6 Effects of plant hormones and H2O2 treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

2.7 不同金屬離子處理后CmABCG8基因的表達特性分析

不同濃度的Fe2+與Cu2+處理后的甜瓜根部CmABCG8基因表達量與對照組相比均呈下降趨勢，且方差分析結果（圖7）顯示，對照組與其它濃度的差異性極顯著。不同濃度Mn2+中，當濃度達到6.8 mg/L時表達量達到最高，與對照組相比，表達量的差異性達到顯著性水平（圖7）。

圖7 不同金屬離子處理對CmABCG8基因表達特性的影響Fig.7 Effects of different metal ion treatment on the expression characteristics of CmABCG8 gene

3 討論

近年來，ABC轉運蛋白在擬南芥、番茄、水稻中均有報道，認為該蛋白能夠將外源毒性物質發生螯合作用，并將其從細胞質運入液泡，減少其對植物的傷害。隨著研究的不斷深入，植物中ABC轉運蛋白的更多功能逐漸被發現。ABCG作為ABC轉運蛋白家族中最大的亞家族，深受廣大研究人員的關注，該亞家族成員可以通過響應一些植物激素或植物激素前體，在植物的生長和代謝過程中發揮著重要作用［22］。本文通過生物信息學和表達特性分析，來判斷甜瓜CmABCG8行使的功能。通過蛋白網絡互作圖，預測到甜瓜CmABCG8與10個蛋白有相互作用，其中Dehydrin蛋白可以調控植物響應低溫脅迫效應［23］；Ferredoxin-nitrite蛋白參與了高等植物硝酸鹽同化還原為氨的過程［24］；Patellin蛋白具有轉移脂質的能力，能在生物膜運輸等過程中發揮功能［25］，可在植物激素和環境變化的調控下參與細胞分裂的過程［26］，煙草中的Patellin蛋白，能參與植物對病毒的防御［27］；NRT蛋白位于細胞原生質膜上，參與NO3-從土壤中根際向植株體內的轉運和植株體內NO3-在器官、組織和細胞間的再度運輸［28］；Thioredoxin蛋白是過氧化物酶家族的一員，能夠替代金屬離子輔基所發揮的功能，清除各種過氧化物，并且植物體內的葉綠體硫氧還原蛋白，可介導環境信號到葉綠體蛋白，維持植物體細胞氧化還原穩定性，提高植物本身的抗逆性［29-31］。因此猜測CmABCG8在甜瓜中可能具有類似這些蛋白的功能。

基因表達差異能夠揭示基因行使的功能，使用實時熒光定量的技術能夠分析出基因的作用和功能。通過不同金屬離子對甜瓜根部處理后，發現CmABCG8的表達量呈下降的趨勢，但隨著金屬離子濃度的增加，表達量有回升的趨勢，在Mn2+的濃度達到6.8 mg/L時表達量有明顯的上升，推測CmABCG8對不同的金屬離子存在劑量效應。通過果實不同時期的表達量，得出CmABCG8基因在果實發育前期表達量很高，而在果實發育后期不明顯，該結果與甜瓜轉錄組得到的數據完全一致，可說明CmABCG8基因在果實發育前期發揮一些作用。通過外源H2O2和植物激素CTK、BR對甜瓜幼苗處理，表達特性結果顯示，3種處理均能大幅度影響CmABCG8基因的表達量，與對照相比，隨著濃度增加，均呈現出上升的趨勢，但達到一定濃度后，表達量有下降的趨勢，但還是遠遠高于對照組表達量。推測CmABCG8對不同植物激素的影響存在劑量效應，除可以調節果實發育外，還能抵抗環境壓力［32］，由本試驗結果能看出外源植物激素能夠誘導CmABCG8基因的表達，是否可以通過調節外源植物激素來加強甜瓜面對多種復雜的環境脅迫，還要繼續進行深入研究。

4 結論

甜瓜ABC轉運蛋白亞家族G成員CmABCG8基因在葉中表達量顯著高于其他組織，果實發育早期表達水平較高，H2O2、CTK、BR等處理均能誘導CmABCG8的表達，推測其可能在果實膨大期發揮重要作用，并且CmABCG8可能在甜瓜金屬離子轉運和抵抗非生物脅迫的過程中發揮作用。