水稻咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶基因的原核表達、抗體制備和應用

索青青 吳楠 楊慧 李莉 王錫鋒

（中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

木質素是植物生長發育過程中重要的次生代謝產物，也是合成其它疏水聚合物（如角質、木栓素和孢粉素）以及一系列可溶性特殊代謝物（包括類黃酮、羥基肉桂酸酯、木脂素、單寧和二苯乙烯）所必需的［1］。木質素具有極其重要的生物學功能。首先，它是植物細胞壁的重要組分［2］，幾乎所有的陸地植物和一些藻類都能合成木質素；其次，它在保護植物抵御機械損傷、外來病原物入侵、脅迫響應（如紫外線輻射），水分和養分運輸等方面發揮著重要作用［3］。木質素的生物合成主要是通過苯丙氨酸/酪氨酸代謝途徑［4］，首先苯丙氨酸或酪氨酸脫氨形成肉桂酸，經過羥基化、甲基化和還原等一系列步驟后，形成3種主要單體（對香豆醇、松柏醇和芥子醇）［5］，最終由3種單體脫氫聚合形成一種復雜的酚類聚合物［6］。

咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶（caffeoylcoenzyme A-O-methyltransferase，CCoAOMT）是木質素合成過程中的關鍵酶之一，它是一類S-腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶，在木質素合成途徑中以咖啡酰輔酶A為底物，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基團轉移到底物苯環上，形成阿魏酰輔酶A［7］。咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶與木質素合成過程中的其他酶相比發現較晚。Pakusch等［8］于1989年首次發現并提出可能存在一種催化咖啡酰輔酶A甲基化的甲基轉移酶，且該酶的活性受真菌激活誘導。后在擬南芥、水稻、棉花、煙草等多種植物中都相繼成功克隆到CCoAOMT基因［7］。有研究表明，在煙草中表達CCoAOMT基因序列的反義拷貝導致總木質素含量減少，并伴隨著矮化表型以及葉片和花的形態改變［9］。小麥TaCCoAOMT1基因在莖和根中高表達，它對木質素的生物合成很重要，與莖的成熟度有關［3］。在CCoAOMT基因表達被抑制的轉基因煙草與楊樹中，木質素含量顯著降低［10-11］。由于木質素具有支撐細胞壁的功能，也被認為與植物的抗逆或抗病性有關［12］。甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因的過量表達能夠提高煙草對干旱、高鹽脅迫的抗性［13］。最新研究表明擬南芥CCoAOMT1基因可通過調節 H2O2積累和脫落酸信號傳導在響應干旱脅迫中發揮積極作用［14］。該酶對于水稻生長發育以及抗逆抗病性等方面中的功能研究少見報道，目前僅有研究證明水稻中3個OsCCoAOMT基因（OsCCoAOMT1、OsCCoAOMT20、OsCCoAOMT26）可能與植物中木質化進程有關［15］。

為進一步了解OsCCoAOMT1基因在水稻生長發育、營養利用和抗病中的重要作用，急需制備該基因所編碼蛋白的抗體。本研究通過PCR擴增技術克隆得到OsCCoAOMT1基因，并將其構建在原核表達載體上，轉化大腸桿菌，表達重組蛋白，蛋白經純化后，注射新西蘭公兔，成功獲得了多克隆抗體。對該抗體進行純化后檢測其特異性與有效性，并通過免疫熒光手段將抗體標記水稻原生質體觀察該蛋白在水稻細胞中的定位情況，為后續對水稻咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶的功能研究奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試水稻品種為鎮稻99，由本實驗室長期保存，置于光期14 h，溫度為30℃；暗期10 h，溫度為28℃的光照培養箱中生長。

1.1.2 菌株和載體 原核表達載體pET30a（+）購自Invitrogen公司（美國），原核表達菌株大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）購自全式金公司。

1.1.3 實驗試劑 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent，2 × Phanta Max Master Mix（Dye Plus），2× Universal Ligation Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內切酶NdeI和Hind III購自北京康潤誠業生物科技有限公司（GenStar）；IPTG、NC膜購自Sigma公司（美國）；DNA回收試劑盒購自艾德科技（北京）有限公司；質粒小提試劑盒購自Axygen公司（美國）；Dylight 568購自美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及目的基因的克隆 根據OsCCoAOMT1基因編碼區序列設計帶酶切位點NdeI和Hind III的引物OsCCoAOMT1-F1：5'-CATATGATGGCCGAGGCGGCGTCG-3'（引入酶切位點NdeI）；OsCCoAOMT1-R1：5'-AAGCTTTCACTTGACGCGGCGGCAGAG-3'（引入酶切位點Hind III）。

利用Trizol法提取水稻總RNA，反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，利用帶有酶切位點的上下游引物進行PCR擴增得到同樣帶有酶切位點的目的基因片段。

1.2.2 原核表達載體的構建 用限制性內切酶NdeI和Hind III雙酶切純化后的目的基因片段和pET30a（+）載體，將酶切后的目的基因片段和pET30a（+）載體用2 × Universal Ligation Mix連接，得到原核表達載體pET30a（+）-OsCCoAOMT1。

1.2.3 重組蛋白誘導表達 將重組質粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中。挑選3個生長良好的陽性克隆，分別接種到含有50 μg/mL卡那霉素的4 mL 液體LB培養基中。置于37℃的搖床中，以200 r/min的轉速搖動。當OD600值達到0.6-0.8時，在其中兩個離心管中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，分別在15℃下誘導16 h和37℃下誘導4 h，最后一個離心管作為陰性對照不加入IPTG。后將菌液離心，收集沉淀，加入300 μL裂解緩沖液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，5%甘油pH = 8.0）在超聲破碎儀中超聲破碎1 min。將50 μL 5×Loading buffer與100 μL細胞裂解液混合，作為全細胞裂解液樣品。100℃沸水中加熱樣品10 min，并在15 000 r/min下離心5 min。將剩余的200 μL細胞裂解液在15 000 r/min下離心10 min，收集細胞裂解液上清液和沉淀，分別將90 μL 5×Loading buffer與180 μL上清液混合，作為細胞裂解液上清液樣品。用150 μL 5×Loading buffer重懸沉淀，作為細胞裂解液沉淀樣品。將樣品在100℃沸水中加熱10 min，15 000 r/min下 離 心5 min，利 用SDSPAGE電泳對所得上清和沉淀樣品進行檢測。

1.2.4 抗體制備和Western blot檢測 為了進一步得到OsCCoAOMT1可溶性蛋白，將其按照最優條件誘導，菌體經超聲破碎后離心，收集上清，Ni2+-NTA抗原親和柱純化蛋白，純化后的蛋白注射于新西蘭公兔，經3次加強免疫后收集相應的抗血清。提取水稻莖和葉總蛋白，通過Western blot對抗體進行特異性檢測。

1.2.5 免疫熒光法標記原生質體 原生質體來源于本實驗室前期創制的超表達帶有GFP熒光標記OsCCoAOMT1的轉基因水稻（轉錄倍數提高21倍）及其野生型水稻品種鎮稻99，利用酶解法提取水稻莖部原生質體，向細胞培養皿中加入500 μL 原生質體懸液，再用滴管小心的滴入4%多聚甲醛，室溫固定1 h；300 r/min離心5 min，用寬口槍頭小心吸除固定液，8%甘露醇洗3次，每次5 min；向培養皿中加入300 μL 制備的OsCCoAOMT1蛋白抗體稀釋液（抗體用3% BSA按1∶100稀釋），于室溫孵育1-2 h；300 r/min離心5 min，用寬口槍頭小心吸去抗體稀釋液，8%甘露醇洗3次，每次5 min；考慮到轉基因水稻帶有GFP熒光標記，采用Dylight 568標記的二抗，37℃孵育1-2 h；8%甘露醇洗去殘留的二抗，制片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察該蛋白在原生質體中的定位。

2 結果

2.1 目的基因OsCCoAOMT1的克隆

以水稻幼苗總RNA反轉錄后的cDNA為模板，用PCR擴增方法得到目的基因OsCCoAOMT1全長782 bp，與預期結果相符（圖1）。將目的基因片段切膠回收，并用限制性內切酶NdeI和Hind III進行雙酶切。

圖1 OsCCoAOMT1基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplifying product of OsCCoAOMT1 gene

2.2 原核表達載體的構建

將pET30a（+）載體用限制性內切酶NdeI和Hind III進行雙酶切，與酶切后的目的片段相連接，并轉化E. coliBL21（DE3）感受態細胞中，涂布在帶有卡那霉素抗性的平板上，篩選陽性克隆后提取重組質粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1，將陽性質粒測序并以NdeI和HindIII雙酶切驗證。測序結果顯示克隆片段序列與目的序列相似性為100%，酶切陽性質粒可得到兩條帶，分別為5 422 bp和782 bp（圖2），表明該載體已成功構建。

圖2 重組質粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1的酶切鑒定Fig.2 Restriction identification of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1

2.3 重組蛋白的表達與純化

挑取陽性單菌落于LB液體培養基中培養，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，分別在15℃條件下誘導16 h和37℃條件下誘導4 h后，加入細胞裂解液得到全細胞裂解液、上清和沉淀樣品，經SDSPAGE電泳（圖3）與Western blot（圖4）對所得樣品進行檢測，結果表明該蛋白最佳誘導條件為IPTG終濃度為0.5 mmol/L下37℃下誘導4 h，并且該蛋白在上清中有較高的含量。在該誘導條件誘導重組蛋白大量表達，菌體經超聲破碎后離心，收集上清，Ni2+-NTA抗原親和柱純化蛋白，純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳（圖5）可知其蛋白條帶單一，并通過BCA法測定純化后的蛋白濃度達到0.83 mg/mL。

圖3 重組質粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1不同誘導條件下的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1 under the different inducing condition

圖4 重組質粒pET30a（+）-OsCCoAOMT1不同誘導條件下的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant plasmid pET30a（+）-OsCCoAOMT1 under the different inducing condition

圖5 OsCCoAOMT1蛋白的純化Fig.5 Purification of OsCCoAOMT1 protein

2.4 OsCCoAOMT1抗體制備和Western blot

將純化后的OsCCoAOMT1蛋白注射于新西蘭公兔，經3次加強免疫后收集相應的抗血清。為了檢測 OsCCoAOMT1抗體的特異性，分別提取水稻莖、葉總蛋白，以同樣的OsCCoAOMT1抗體濃度（1∶1 000）進行Western blot，結果表明，不同組織的水稻總蛋白均顯示目的大小的條帶（圖6），且由條帶強弱可知該蛋白在水稻不同部位的表達量不同，莖中的表達量要高于葉。同時將水稻幼苗總蛋白（3.8 mg/mL）分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍，在相同抗體濃度（1∶1 000）下孵育，均可得到單一目的條帶，并且條帶逐漸變弱（圖7）。以上結果表明該抗體可以廣泛應用于水稻的不同組織和部位，并且具有較高的靈敏度和良好的特異性。

圖6 水稻莖、葉中OsCCoAOMT1的Western blot 檢測Fig.6 Western blot analysis of OsCCoAOMT1 in rice stem and leaf

圖7 水稻不同蛋白濃度Western blot檢測Fig.7 Western blot analysis of different protein concentrations in rice

2.5 原生質體標記

參考本實驗室已有的方法［16］，對野生型和轉基因水稻莖原生質體進行免疫熒光標記，野生型和轉基因水稻在激光共聚焦顯微鏡下均可檢測到抗體信號（圖8），且轉基因水稻的GFP信號可以與抗體的信號共定位。同時對水稻莖的細胞質與細胞核蛋白進行分離，而后分別對細胞質蛋白和細胞核蛋白進行Western blot，結果（圖9）表明，同等樣品下胞質中OsCCoAOMT1蛋白含量遠高于其在細胞核中的含量，說明OsCCoAOMT1蛋白主要存在于細胞質中。因此可以充分說明該抗體特異性良好，且可特異性的用于免疫熒光分析。

圖8 OsCCoAOMT1蛋白在野生型（A）和轉基因（B）水稻莖原生質體中的定位分析Fig.8 Location analysis of OsCCoAOMT1 protein in the wild-type（A）and transgenic（B）rice stem protoplasts

圖9 OsCCoAOMT1蛋白在水稻細胞質和細胞核中的表達量分析Fig. 9 Expression level analysis the OsCCoAOMT1 protein in rice cytoplasm and nucleus

3 討論

利用原核表達重組蛋白免疫動物來制備抗體是研究蛋白質功能的重要手段之一［17］。通過原核表達獲得大量的抗原蛋白，可用于蛋白性質、功能、蛋白間相互作用及多種生化功能的研究［18］。本文首先構建原核表達載體pET30a（+）-OsCCoAOMT1，再轉化到大腸桿菌感受態細胞中。誘導條件是原核表達系統表達外源蛋白的重要因素［19］，因此我們選擇了在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，在不同的溫度，不同時間下誘導，優化獲得了該蛋白高效表達的最佳誘導條件：37℃條件下誘導4 h。當制備多克隆抗體時，作為抗原的蛋白質純度越高，獲得的抗體特異性越好［20］。由于OsCCoAOMT1蛋白在上清中的表達量更高，因此我們選擇Ni2+-NTA親和柱純化，獲得高純度的蛋白后將其免疫新西蘭公兔，成功制備了多克隆抗體。

關于OsCCoAOMT1蛋白的具體功能及其在水稻生長發育以及抗病防御機制中的研究較少。最近有研究表明，編碼玉米咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶基因ZmCCoAOMT2對多種病原菌具有數量抗性，且在擬南芥Col-0中，CCoAOMT1基因也在病原體或激發子處理后被誘導，推測其可能在抗性功能中起重要作用［21］。OsCCoAOMT1基因作為水稻木質素合成過程中的重要酶，僅有研究表明其可能參與調控水稻的木質化進程［15］。本研究用制備的抗體對水稻不同組織和部位進行Western blot 檢測發現OsCCoAOMT1蛋白在水稻莖部和葉部均有表達，且莖中表達量高于葉中表達量，由此推測其可能在水稻莖的伸長及營養運輸等方面發揮重要作用。通過免疫熒光法對轉基因和野生型水稻莖原生質體進行標記，激光共聚焦顯微鏡可觀察到轉基因水稻的GFP信號可以與抗體的信號共定位，說明該抗體特異性好，可后續用于免疫熒光分析，同時將水稻莖核質蛋白分離，經Western blot檢測可知該蛋白主要定位在細胞質中，推測其可能參與細胞質相關代謝過程。但也有相關研究表明甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT蛋白可定位于細胞核、質膜上［22］，因此關于該蛋白的定位情況還有待深入研究。

4 結論

本研究利用重組DNA技術成功構建了pET30a（+）-OsCCoAOMT1原核表達載體，確定了該蛋白的最佳誘導條件為IPTG終濃度0.5 mmol/L，37℃下誘導4 h，在該條件下大量表達和純化該蛋白，成功制備了OsCCoAOMT1蛋白的多克隆抗體。OsCCoAOMT1蛋白在水稻莖部表達量更高，推測其可能參與水稻莖部生長發育和營養運輸，且該抗體可特異性的用于免疫熒光分析，為后續研究其在水稻生長發育以及抵抗病原侵染等功能奠定了基礎。