水稻葉和籽粒鎘積累機制及QTL定位研究

黃婧 朱亮，2 薛蓬勃，2 付強

（1. 廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004；2. 廣西大學生命科學與技術學院，南寧 530004）

鎘（cadmium，Cd）是生物毒性最強的重金屬之一，低劑量（0.1-1 mg/kg）即抑制動植物的生長繁殖［1］。隨著工業化的發展，我國受鎘、砷、鉛等重金屬污染的耕地面積近2 000萬hm2，約占耕地總面積的20%，每年生產鎘含量超標的農產品達14.6億kg，且有逐漸加重的趨勢［2］。水稻（Oryza sativaL.）是世界上約一半人口的主食，稻米是很多國家飲食中攝取鎘的最主要來源［3］。鎘在人體內積累不易排出，且半衰期長，對腎臟、肝臟和骨骼等造成危害，甚至引起癌癥［4］。因此，選育籽粒低鎘積累的水稻品種，最大限度減少鎘攝入量，對于保障糧食安全和人類健康具有重要意義［5］。

鎘在植物體內的分布是一個由根質膜轉運蛋白介導的根吸收、木質部裝載和卸載，以及韌皮部裝載和卸載所共同控制的連續的動力學過程［6］。水稻Cd積累相關性狀屬數量性狀，遺傳機制復雜，同時受環境因素影響。不同基因型的水稻地上部分和籽粒中Cd的含量存在很大的差異，這為研究水稻低Cd積累的生理和遺傳機制提供了非常有用的種質資源［7］。近年來，已有研究利用不同的低Cd/高Cd水稻品種組合構建的F2、RIL、CSSLs等群體鑒定出不少控制Cd積累的QTL，在水稻12條染色體上均有分布［8-19］。除了OsHMA3［12］、OsCAL1［15］等基因外，上述研究中鑒定的QTL均未克隆到主效基因，關于控制Cd從根到莖轉運繼而進入籽粒的遺傳機制仍不明確，亟待研究。

本研究通過離子組學技術，系統分析中國栽培稻核心種質資源209個品種籽粒的離子譜，鑒定了一批Fe、Zn等籽粒部位高富集以及Cd低積累的水稻品種，為優良品種的篩選和雜交育種提供了種質資源。另一方面，開展水稻Cd積累生理試驗和QTL定位分析，為闡明水稻Cd積累遺傳機制、運用分子標記輔助選育籽粒Cd含量低而Fe、Zn等營養元素均衡富集的水稻品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

中國栽培稻（Oryza sativaL.）核心種質資源209份，由上海市農業生物基因中心提供。秈稻花楸03和粳稻SKC為親本構建DH群體，包含137個株系。

1.2 方法

1.2.1 水稻種質資源籽粒的離子譜測定 中國栽培稻核心種質資源的209份，每份隨機挑選5粒籽粒至50 mL FalconTM管中，80℃烘箱中，24-48 h。加入5 mL硝酸（MOS級），在 SPB 50-48型石墨消解儀（Perkin Elmer）上進行消解（120℃，30 min）。冷卻至室溫后，用Milli-Q水定容至50 mL，選取上清10 mL，并用電感耦合等離子質譜儀ICP-MS（ELAN DRC-e，Perkin-Elmer）測量其中14種必需元素和Cd、Pb等有毒重金屬元素的含量，計算測量群體的平均值和標準差，最后計算出Z值［Z值=（樣本元素濃度-平均值）/標準差］，用以表示樣品中某元素含量偏離群體平均值的程度。

1.2.2 水稻的培養條件 生理學試驗中，SKC和花楸03的種子浸泡于Milli-Q水中，28℃，避光48 h。去除液體，用濕的布巾包裹種子，密封，28℃避光24 h，萌發的種子轉入水稻培養液。人工氣候箱設置為相對濕度70%，光照周期為13 h光照（溫度為28℃）/11 h黑暗（溫度為25℃），光照強度80-200 mol/（m2·s）。大田及水槽種植試驗區位于廣西省南寧市郊的鎘污染農田，于當年4月在秧田播種，5月移栽，各株系分別挑選20株長勢一致的秧苗移栽，每株系插4行，每行5株。在秧苗生長期間進行常規田間管理，及時除草除蟲，注意避免雨天水位上漲淹沒秧苗。

1.2.3 生理學試驗

1.2.3.1 Cd的耐受性分析 對照組和試驗組水稻種子萌發后，分別種植于添加了0、0.2、1和5 μmol/L CdCl2的水稻培養液中，并置于人工氣候箱培養12 d后，分別選取地上和地下部分材料測量鮮重并進行統計分析。

1.2.3.2 不同試驗中的Cd處理條件 水稻種子萌發后直接在添加0、0.2、1或5 μmol/L CdCl2的培養液中培養2周，然后取地上部材料，測量水稻葉中Cd的積累。分別以0、0.2、1、5、10或25 μmol/L CdCl2處理兩葉一心期苗7 d后，分別對地上部和地下部取材，進行Cd濃度梯度試驗。兩葉一心期苗經10 μmol/L CdCl2分別處理0、1、2、3、4或5 d后，分別對地上部和地下部取材，進行Cd時間梯度處理試驗。兩葉一心期苗在正常培養條件（28℃，A）和低溫條件（4℃，B）下分別用0、0.2、1、2和5 μmol/L CdCl2處理20 min后，選取根進行根吸收動力學試驗。

1.2.3.3 水稻組織中Cd含量的測定 按照1.2.3.1和1.2.3.2處理后取材，將水稻地上部和根材料分別用Milli-Q水、CaCl2及Milli-Q水清洗，置于80℃烘箱中，24-48 h。烘干的植物材料，稱取10-20 mg至50 mL FalconTM管中。加入5 mL硝酸（MOS級），在石墨消解儀上進行消解（120℃，30 min）。冷卻至室溫后，用Milli-Q水定容至50 mL，選取上清10 mL，并用ICP-MS測定各組織材料中的Cd含量。

1.2.4 土壤中元素含量的測定 在大田及污染、對照水槽土壤中元素含量的測定試驗中，采用等間距采樣法，共設10個采樣點，采集深度為5 cm左右的耕層土壤，自然風干并將土塊碾碎后封存。將各點采集的試樣混合后，反復按四分法棄取，每個樣品設3個重復。每份準確稱取0.1 g土壤，采用王水回流法酸解樣品，用Milli-Q水定容至50 mL后，選取上清10 mL，并用ICP-MS進行測定。

1.2.5 水稻Cd積累的QTL定位 以秈稻花楸03和粳稻SKC為親本構建包含137個單株的DH群體。對葉中Cd積累進行QTL定位時，將DH群體植株種植于水稻營養液中，并置于人工氣候箱培養。兩葉一心期苗以10 μmol/L CdCl2處理7 d后取樣。每個株系取5個單株的地上部分混收為一份材料，設置4個重復，并用ICP-MS測定Cd含量。對籽粒中Cd積累進行QTL定位時，將DH群體植株種植于Cd污染的水槽土壤中，每個株系種植20個單株。收種后脫粒取谷粒測量Cd含量，每個株系取5個單株，每個單株隨機選取10粒谷粒混收為一份材料，設置4個重復，并用ICP-MS測定Cd含量。

利用MAPMARKER/EXP3.0程序［20］進行連鎖分析，構建高密度SRR（simple sequence repeat）分子標記連鎖圖譜，SSR分子標記引物序列信息來源于Gramene網站（www.gramene.org）。結合分子標記連鎖圖和Cd含量測定結果，利用MAPMAKER/QTL程序［21］進行QTL分析。

2 結果

2.1 水稻核心種質資源籽粒的離子譜

系統分析中國栽培稻核心種質資源209個品種籽粒（見附表）的金屬離子譜，鑒定出20余個Cd、Fe、Zn、Mn等含量差異顯著的水稻品種（圖1）。從中挑選出Cd含量差異顯著而Fe、Zn、Mn等含量差異不顯著的秈稻品種花楸03（HQ03）和粳稻品種SKC進行后續研究。另一方面，如圖2所示，DPS軟件統計學分析表明，水稻籽粒中Cd2+與Fe2+、Zn2+、Mn2+無拮抗關系（P>0.05），而Fe2+、Zn2+和Mn2+之間存在極顯著的協同關系（P<0.01）。

圖1 核心種質資源水稻籽粒中Cd的積累Fig. 1 Profiling of Cd accumulation in grains of rice core germplasm

圖2 水稻籽粒中Cd2+、Fe2+、Zn2+和Mn2+元素的相關關系Fig. 2 Correlation among Cd2+, Fe2+, Zn2+ and Mn2+ elements in rice grains

2.2 花楸03與SKC籽粒中的Cd含量的測定

為在同樣生境下比較花楸03與SKC籽粒中的Cd含量，將這兩個品種分別在受污染大田、Cd污染水槽和對照水槽土壤中種植。如表1所示，土壤中Cd含量高低依次為：污染水槽>大田土壤>對照水槽，Fe、Zn、Cu和As等元素含量在污染水槽和大田中差異不顯著。

表1 大田、鎘污染水槽和對照水槽土壤中Cd等元素的含量Table 1 Contents of Cd and other metals in the soil of contaminated paddy field，contaminated sink and control sink（μg·g-1 DW）

籽粒中Cd含量高低依次為：污染水槽>大田土壤>對照水槽，與土壤中Cd含量高低的趨勢一致（圖3-A）。除了對照水槽中兩品種的Cd含量均在檢測限附近外，其余情況下花楸03籽粒中的Cd含量均顯著高于SKC，與圖1結果一致（圖3-A，P<0.01）。而污染水槽中的花楸03與SKC精米中的Cd含量較低且差異不顯著（圖3-B，P>0.05）。

圖3 花楸03與SKC的籽粒和精米中的Cd含量Fig.3 Cd accumulation in the grains and milled rice of HQ03 and SKC

2.3 花楸03與SKC葉中Cd積累差異顯著，而對Cd的耐性和吸收無顯著差別

鑒于花楸03與SKC籽粒中Cd積累差異顯著，首先檢測這兩個品種地上部和地下部Cd積累是否也存在差異。種子萌發后直接在添加CdCl2的培養液中生長，葉片中的Cd含量隨著CdCl2處理濃度的升高而升高，且花楸03葉中的Cd含量始終顯著高于SKC（圖4-A，P<0.01）。兩者葉中Fe、Zn、Mn等金屬元素和K、Mg、Ca等大量元素的含量無顯著差異（圖4-B、C）。

圖4 花楸03與SKC葉片中的元素積累Fig.4 Elements accumulation in the leaves of HQ03 and SKC

對兩葉一心期苗分別進行CdCl2濃度梯度和時間梯度的處理，發現葉片中的Cd含量具有濃度梯度和時間梯度的依賴性（圖5）。除Cd含量均較低情況外，花楸03葉中的Cd含量始終顯著高于SKC（圖5-A、B），而根中Cd含量則無顯著差異（圖5-C、D）。

圖5 不同濃度和不同時間CdCl2處理后花楸03和SKC幼苗葉片與根中Cd的積累Fig.5 Cd accumulation in the leaves and roots of HQ03 and SKC from rice seedlings exposed to CdCl2 for indicated concentrations and days

由于兩品種葉中Cd積累差異顯著，接下來檢測它們對Cd的耐受性。種子萌發后直接在添加CdCl2的培養液中生長，對照及不同濃度Cd處理下，花楸03和SKC地上部（圖6-A）和地下部（圖6-B）的鮮重均無顯著差異，說明這兩個品種對Cd的耐受性無顯著差別。

圖6 花楸03與SKC對Cd的耐受性分析Fig. 6 Tolerance assay of HQ03 and SKC to Cd

為明確花楸03與SKC葉中Cd積累差異是由根吸收還是從根向莖的轉運差異所導致，對兩品種進行了根吸收的動力學研究。如圖7所示，無論是在正常培養條件（圖7-A）還是低溫條件下（圖7-B），兩品種根吸收Cd的動力學曲線均基本重合，說明花楸03和SKC對Cd的吸收能力無顯著差異。

圖7 花楸03和SKC的根吸收試驗Fig.7 Root uptake assay of HQ03 and SKC

2.4 DH群體的QTL定位

以秈稻花楸03和粳稻SKC為親本構建了包含137個單株的DH群體，各株系葉和籽粒中的Cd積累量數據呈連續正態分布，表現出數量性狀的遺傳特點，符合QTL區間的作圖要求。共檢測到8個控制Cd在水稻葉和籽粒中積累的QTL，分別位于第2、3、4、7、8、10和11染色體上（表2、表3和圖8）。

圖8 水稻葉和籽粒Cd積累的QTL定位示意圖Fig.8 QTLs mapping of Cd accumulation in the rice leaves and grains

表2 水稻葉Cd積累的QTL定位Table 2 Quantitative trait loci（QTLs）mapping for Cd accumulation in rice leaves

表3 水稻籽粒Cd積累的QTL定位Table 3 Quantitative trait loci（QTLs）mapping for Cd accumulation in rice grains

3 討論

水稻是我國最重要的糧食作物，土壤重金屬鎘的污染不僅導致水稻生長發育受阻，產量下降，還會在水稻體內大量累積并通過食物鏈傳遞，危害國民健康［1，3-5］。因此，研究水稻鎘耐受和積累的機制，降低水稻籽粒中Cd含量從而最大限度的減小Cd的攝入量，對于保障糧食安全和人類健康具有重要意義。

不同基因型水稻地上部分和籽粒中Cd的積累存在很大的差異，為研究水稻低Cd積累的生理和遺傳機制提供了非常有用的種質資源［9］。利用不同低Cd/高Cd積累水稻組合構建的群體鑒定出不少控制Cd積累的QTL。如Xue等［8］報道了水稻中6個與Cd耐性相關和3個與Cd濃度相關的QTL。Ueno等［9］在第11染色體上鑒定到控制水稻地上部分Cd含量的主效QTL。Ishikawa等［10］將控制水稻籽粒Cd積累的QTL定位到第2和7染色體上，并將其中主效QTLqGCd7定位到第7染色體的短臂上。Hu等［16］利用DH群體定位到18個糙米和14個精米QTL，分別定位于2、3、4、5、7、9和11染色體上。Liu等［17］在第2、3、6、7、8和10染色體上鑒定到7個控制籽粒Cd濃度的QTL。Ueno等［11］利用Nipponbare/Anjana Dhan構建的群體，Miyadate等［12］利用Cho-Ko-Koku/Akita 63構建的群體，先后克隆出根液泡膜上Cd的轉運蛋白基因OsHMA3；Luo等［15］利用CJ06/TN1構建的群體，鑒定出控制Cd在葉中積累的防御素類似蛋白CAL1。除此之外，其他研究中鑒定出的QTL均未克隆到主效基因，關于控制Cd從根到莖繼而向籽粒中轉運的遺傳機制仍不明確。

本研究首先利用ICP-MS離子組學高通量分析手段測定了中國栽培稻核心種質資源209個品種籽粒的離子譜，從中鑒定出Fe、Zn等高積累以及Cd低積累的品種20余個，為優良品種的篩選和雜交育種提供了較為詳實的參考資料。統計學分析籽粒中各元素的相關關系，發現Fe2+、Zn2+和Mn2+之間存在協同關系，這些元素同屬二價重金屬，在化學結構上具有很大的相似性，很可能在一定程度上共享植物體內的吸收轉運機制。本研究中未觀察到Fe2+、Zn2+、Mn2+與Cd2+等重金屬元素存在拮抗關系，原因可能在于籽粒中Cd2+、Pb2+等重金屬含量較低，且其產地重金屬污染狀況可能并不一致。

QTL定位的親本選擇對于基因挖掘至關重要，親本差異越顯著越有利于發現更多更穩定的QTL。因此，本研究挑選了Cd含量差異顯著的秈稻品種花楸03和粳稻品種SKC作為親本構建DH群體，并對它們進行了一系列的生理學實驗分析。盡管花楸03和SKC對Cd的耐性無顯著差異，花楸03葉和籽粒中的Cd含量顯著高于SKC。此外，這兩個品種精米中的Cd含量均很低且差異不顯著，說明Cd在籽粒中可能積累于胚、糊粉層或者穎殼。花楸03和SKC根中的Cd含量以及根吸收動力學研究均表明，它們對Cd的吸收能力不顯著。該結果與文獻中報道的結果一致，普遍認為木質部介導的根-莖長途轉運是決定水稻地上部分和籽粒Cd積累的主要生理過程［22］。而這兩個品種籽粒和地上部分中Fe、Zn、Mn等微量元素及K、Mg等大量元素的含量均無顯著差異，說明這兩個品種Cd積累差異可能與Fe2+、Zn2+等二價陽離子的轉運系統無關。因此，利用這兩個親本開展QTL定位對于選育籽粒Cd低積累的優良品種具有重要價值，該過程中基因的鑒定有助于了解控制Cd向地上部分以及籽粒中轉運的過程。

DH群體定位共檢測到8個控制Cd積累的QTL，分別位于第2、3、4、7、8、10和11染色體上，能解釋10.6%-39.4%的表型變異。QTL分析表明，無論是葉還是籽粒中，Cd與Fe、Zn均未參與共定位（數據待發表），與葉和籽粒中Fe等金屬元素積累結果相一致。說明這兩個品種的Cd積累差異可能與Fe2+、Zn2+等二價陽離子的轉運系統無關，暗示控制Cd轉運的QTL可能是特異性的。研究發現控制Cd向地上部分和籽粒轉運的QTL存在較大差異，推測水稻中這兩個過程可能具有不同的調控機制。第2染色體上同時檢測到控制Cd向葉和籽粒轉運的QTL，在染色體上位置與OsCAL1［15］接近；第7染色體上檢測到的QTL與OsHMA3［12］和OsNRAMP5［23］接近；第10染色體上檢測到的QTL與Xue等［8］接近。此外，其余4個QTL未見已報道的Cd積累相關基因落在相關區域。其中，第3染色體上檢測到的控制Cd向籽粒轉運的QTL（qGCd3）定位至RM6266-RM2334的21 cM區間，LOD值（3.81）和貢獻率（39.4%）均較高。試驗誤差、環境影響以及定位群體的背景差異，會造成同一QTL的貢獻率及LOD值在不同定位群體中會有所變化。LOD值的變化相對較小，是QTL定位中較為可靠的參數，一般說來LOD值在2以上該位點就有QTL的存在。本研究結果說明此位點QTL存在的可能性很高。但這兩個標記之間約21 cM距離，包含近400個基因，需要進一步進行高精確度連鎖分析。目前已構建以花楸03為供體親本，SKC為輪回親本的片段替換系，擬通過高精確度連鎖分析，找到控制鎘向水稻籽粒轉運的主效基因，解析水稻鎘積累的分子機理。

4 結論

從花楸03和SKC構建的DH群體中共檢測到8個控制Cd在葉和籽粒中積累的QTL。水稻中控制Cd向地上部分和籽粒轉運的調控機制不同，其中木質部介導的根-莖長途轉運是決定水稻地上部分和籽粒Cd積累的主要生理過程。第3染色體上檢測到的QTLqGCd3處可能存在一個控制鎘向籽粒轉運的重要基因。

文章所有附表數據請到本刊官網下載（http://biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml）。