小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白g11335的生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位及毒性驗(yàn)證

郭志浩 金澤鑫 劉琦 高利

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊, 830052；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

由小麥矮腥黑粉菌（Tilletia contraversaKühn，TCK）引致的小麥矮腥黑穗病，是我國(guó)的一類檢疫性病害，也是一種重要國(guó)際檢疫性病害［1］。該病害對(duì)小麥生產(chǎn)具有破壞性，其發(fā)病率約等于小麥減產(chǎn)率，并可使小麥產(chǎn)量減少80%以上，甚至導(dǎo)致小麥顆粒無(wú)收。該真菌可以通過(guò)種子、土壤、空氣等傳播并且可以在土壤中生活多年，一旦引入很難根除。目前此病害已在世界范圍內(nèi)傳播擴(kuò)散，并帶來(lái)極大的損失，在40多個(gè)國(guó)家被列為檢疫性病害，嚴(yán)重威脅著世界農(nóng)業(yè)發(fā)展與人類健康［2］。近年來(lái)我國(guó)每年進(jìn)口小麥400萬(wàn)t，隨著我國(guó)加入WTO和“一帶一路”政策的實(shí)施，小麥的進(jìn)口風(fēng)險(xiǎn)不斷增加。

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的三大主糧作物之一，小麥的安全生產(chǎn)和病害防控對(duì)確保國(guó)家糧食安全有著重大的戰(zhàn)略意義［2］。我國(guó)的小麥生產(chǎn)中，冬小麥占據(jù)絕大多數(shù)，而冬小麥?zhǔn)前群谒氩〉闹饕闹鳌ｋS著國(guó)際貿(mào)易及國(guó)際交往的日益頻繁，TCK給我國(guó)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大，如果TCK沒有得到很好的控制，我國(guó)作為小麥生產(chǎn)國(guó)將會(huì)受到其巨大威脅，并對(duì)糧食生產(chǎn)和民生造成無(wú)法估量的損害［3］。因此，分析該病原菌侵染小麥的機(jī)制，對(duì)于有效預(yù)防和控制該病害具有重要意義。

小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白g11335為GSDH家族的效應(yīng)蛋白，該家族的成員為葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶。GSDH家族的一些相似家族UGDH家族和CbGDH家族的成員具有對(duì)植物體產(chǎn)生影響的報(bào)道。雷胤民［4］研究表明了GSDH家族的相似家族UGDH家族的蛋白尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶可以通過(guò)多糖代謝調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育。楊穎［5］研究發(fā)現(xiàn)GSDH家族的相似家族UGDH家族尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶能夠?qū)DP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖醛酸，在毛竹體內(nèi)的半纖維素合成中起關(guān)鍵作用。陳英［6］證明了GSDH家族的相似家族CbGDH家族葡萄糖脫氫酶很可能與復(fù)合酶協(xié)同提高了竹筍膳食纖維的理化性質(zhì)。因此GSDH家族的成員葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶是否能對(duì)植物體產(chǎn)生影響便成為了值得關(guān)注的研究。

本研究利用TCK基因組數(shù)據(jù)克隆出TCK的效應(yīng)蛋白基因g11335，對(duì)該蛋白生物信息學(xué)進(jìn)行分析，通過(guò)構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析［7-8］，為小麥矮腥黑粉菌的后續(xù)相關(guān)研究以及對(duì)GSDH家族的后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及接種材料 小麥矮腥黑粉菌race-2生理小種菌株，煙草品種為本氏煙。

1.1.2 試劑 大腸桿菌Trans-t2blue感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。2×Pro Taq Master Mix酶、2×Phanta Flash Master Mix、50 mg/mL卡那霉素、20 mg/mL利福平購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主 要 儀 器 PCR儀，美 國(guó)Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)。超速離心機(jī)，德國(guó)eppendrof生命科學(xué)公司生產(chǎn)。50 mL離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。小型水平電泳儀，美國(guó)Bio-rad公司生產(chǎn)。高壓滅菌鍋，美國(guó)Zealway公司生產(chǎn)。GHB-202恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。大容量全溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。FastPrep-96高通量快速樣品制備儀，美國(guó)MP Biomedicals公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 TCKg11335基因的克隆 收集萌發(fā)后各個(gè)生長(zhǎng)階段（包括初生擔(dān)孢子，次生擔(dān)孢子，H體和侵染菌絲，在土壤培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得）的TCK菌絲，利用Tirzol法提取RNA。再利用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。根據(jù)TCK基因組設(shè)計(jì)引物數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物g11335-F和g11335-R（表1），以用反轉(zhuǎn)錄法獲得的TCK的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：cDNA 模板1 μL，2×Phanta Flash Master Mix 12.5 μL，引物g11335-F 1 μL，引物g11335-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35個(gè) 循 環(huán)；72℃1 min。驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。把目的片段純化回收，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 PGR-107載體的線性化 PGR-107載體線性化的酶切體系如下：PGR-107載體質(zhì)粒5 μL，ClaI酶1 μL，SalI酶1 μL，Loading Buffer 2 μL，用無(wú)菌無(wú)酶水補(bǔ)至20 μL。將體系溶液37℃酶切3 h后電泳，切膠回收目的片段即可得酶切后的PGR-107質(zhì)粒溶液。

1.2.3 TCKg11335-PGR107載體的構(gòu)建 把g11335基因的質(zhì)粒體連接到酶切后的PGR-107，再轉(zhuǎn)入Trans-t2blue大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞；將其中的陽(yáng)性單菌落送北京擎科生物科技公司進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)序正確的單菌落搖菌并提取質(zhì)粒即可得到g11335-PGR107的質(zhì)粒溶液。PGR107載體的測(cè)序引物為PGR107-F和PGR107-R。

1.2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 把測(cè)序正確的g11335-PGR107質(zhì)粒溶液，按照GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書步驟進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)接種呈陽(yáng)性克隆后在LB液體培養(yǎng)基中28℃搖菌擴(kuò)繁，再次擴(kuò)繁出大量的農(nóng)桿菌液。

1.2.5 煙草瞬時(shí)表達(dá) 將BAX和EGFP的農(nóng)桿菌液大量擴(kuò)繁。OD600值調(diào)至0.5，隨后采用等容積的buffer（10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2）溶液進(jìn)行懸浮，并在室溫濕度下靜置約3-4 h活化，然后將下表皮細(xì)胞采用六區(qū)注射法注入長(zhǎng)至四周大的煙草葉子背面，在繼續(xù)培養(yǎng)約4-6 d后觀察煙草葉子的顯癥狀況。

1.2.6 生物信息學(xué)分析方法 獲得g11335的基因序列后，通過(guò)NCBI比對(duì)獲得同名效應(yīng)蛋白g11335氨基酸序列FASTA格式。運(yùn)用（https://web.expasy.org/protparam/）即ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，運(yùn) 用（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）即TMHMMServerv.2.0軟件預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)，并使用NCBI中的Conserved Domains軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析它的結(jié)構(gòu)域，使 用（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=%20npsa_sopma.html）即SOPMA軟 件 來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，用（https://swissmodel.expasy.org/）即Swiss-Model軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模［7］。

1.2.7 效應(yīng)蛋白g11335的亞細(xì)胞定位 首先將pBin載體線性化，酶切體系如下：pBin載體質(zhì)粒5 μL，KpnI酶1 μL，BamH I酶1 μL，Green Buffer 2 μL，用無(wú)菌無(wú)酶水補(bǔ)至20 μL。將體系溶液37℃酶切3 h后，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。將目的片段純化回收即可獲得線性化的pBin載體。

以TCK的cDNA為 模 板，以g11335-YF和g11335-YR（表1）為引物，獲得具有pBin的同源臂的產(chǎn)物，反應(yīng)體系如下：cDNA模板1 μL，2×Phanta Flash Master Mix 12.5 μL，引 物g11335-F 1 μL，引物g11335-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 1 min。驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。將目的片段純化回收，克隆至pBin載體，轉(zhuǎn)入Trans-t2 blue大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12 h待其長(zhǎng)出單菌落。對(duì)單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和亞細(xì)胞定位：將陽(yáng)性菌液轉(zhuǎn)入10 mL的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁（含有50 mg/mL卡那霉素）中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒。利用熱擊轉(zhuǎn)化法按照GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在28℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2-3 d待其長(zhǎng)出單菌落。對(duì)單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將農(nóng)桿菌的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含有50 mg/mL卡那霉素和20 mg/mL利福平）中，28℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取部分培養(yǎng)后的菌液按1∶100的配比，轉(zhuǎn)入10 mL的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，28℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8左右，后用等體 積 的buffer（10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2）重懸菌體，離心棄上清，重復(fù)該步驟3次，再用buffer調(diào)至OD600=0.5左右，并在室溫下靜置3-4 h活化［8］，再由下表皮注射到4周的煙草葉片背面，在2-3 d后，用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草中的定位情況［9］。

2 結(jié)果

2.1 小麥矮腥黑粉菌基因g11335的克隆

以TCK的cDNA為模板，用引物g11335-F和g11335-R（表1）擴(kuò)增出約1.4 kb的目的基因片段。將 PCR凝膠產(chǎn)物回收，測(cè)序后獲得1 389 bp長(zhǎng)度的序列，如圖1所示。

2.2 效應(yīng)蛋白g11335的生物信息學(xué)分析

2.2.1 效應(yīng)蛋白g11335的保守結(jié)構(gòu)域分析 基因g11335全長(zhǎng)1 389 bp，通過(guò)NCBI比對(duì)得效應(yīng)蛋白g11335氨基酸序列FASTA格式：MRVATFLAQASC LLSFATGALAARQLGNLGNVKFTADLWAANITGAR NLVFDAVGDLLVIQTDPNSSTNALDGVAGSGLLFPA VVGLVDFGTIDSPRVKTYPIVQNTSLPQGFIPNHGIEI IDNYLYLSNETSIWRWPYRAGQRRSVSASSAQLFTSN MPWKDDKFFVADGLDLNIDYTDNRSDIRYFPVRSAP IPAGGWDWYSRPIWALGLRNAVGLAIQPVTNWLWE TDQGIDDLYREDLGGDIHNDNPPDELNLLDNWSKPE TVNAQKPYHFGFPYCWTEGNITNASSTVGPHKAGD QWAQYLNRSDYTDAYCKDPKKNIKPLALVQAHAAP LGIQFFNGTGCVNTPNCNSKRNPFTCNYTGQLFFTA HGADNRDRSVGHFFGTFPFSSKTKLPSRPLAAPPAN YDELYGETDQTLCTVSFSGQNCWRPTMIKFDRFGRL FITENNRGEVWRLSIDGTA。

該效應(yīng)蛋白共編碼462個(gè)氨基酸，含有典型GSDH結(jié)構(gòu)域，可能是葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶家族成員，具有β螺旋折疊，如圖2所示。

圖2 效應(yīng)蛋白g11335的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2 Conserved domain analysis of effector g11335

2.2.2 效應(yīng)蛋白g11335理化性質(zhì)分析 效應(yīng)蛋白g11335的相對(duì)分子質(zhì)量為51 270.39 Da，理論等電點(diǎn)pI為5.68，說(shuō)明了蛋白質(zhì)的偏酸。氨基酸總數(shù)則是462個(gè)，其 中 Ala（A）39個(gè)（8.4%）、Arg（R）24 個(gè)（5.2%）、Asn（N）35個(gè)（7.6%）、Asp（D）34個(gè)（7.4%）、Cys（C）8個(gè)（1.7%）、Gln（Q）17個(gè)（3.7%）、Glu（E）11 個(gè)（2.4%）、Gly（G）37 個(gè)（8.0%）、His（H）7 個(gè)（1.5%）、Ile（I）22 個(gè)（4.8%）、Leu（L）40個(gè)（8.7%）、Lys（K）15個(gè)（3.2%）、Met（M）3個(gè)（0.6%）、Phe（F）26個(gè)（5.6%）、Pro（P）30個(gè)（6.5%）、Ser（S）29個(gè)（6.3%）、Thr（T）32 個(gè)（6.9%）、Trp（W）14個(gè)（3.%）、Tyr（Y）16個(gè)（3.5%）、Val（V）23個(gè)（5.0%）。Asp和Glu的總數(shù)即負(fù)電性殘基總數(shù)為45個(gè)，而Arg和Lys的總量即正電荷殘基總數(shù)為39個(gè)。g11335蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)是34.17，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為75.22，而總平均親水性則為-0.333。預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的半衰期是超過(guò)30 h在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中，超過(guò)20 h在酵母中，以及超過(guò)10 h大腸桿菌感染中。該蛋白的親疏水性，最疏水性數(shù)值是2.533，而最親水?dāng)?shù)值則為-2.456。如圖3所顯示，在g11335效應(yīng)蛋白中親水的氨基酸數(shù)量更多，是偏親水蛋白質(zhì)。

圖3 效應(yīng)蛋白g11335的親疏水性圖Fig. 3 Hydrophilicity of effector g11335

2.2.3 效應(yīng)蛋白g11335信號(hào)肽分析 效應(yīng)蛋白g11335信號(hào)肽分析，信號(hào)肽長(zhǎng)度為23個(gè)氨基酸，信號(hào)肽切割位點(diǎn)C的最高值為0.763，位于第23位氨基酸；信號(hào)肽分?jǐn)?shù)S的最高值為0.900，位于第3位氨基酸；合并后切割位點(diǎn)的Y最高值約為0.791，位于第23位氨基酸。S平均值為0.819，所預(yù)測(cè)的切割位點(diǎn)約在1-22位氨基酸之間。如圖4所示。

圖4 效應(yīng)蛋白g11335信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig. 4 Signal peptide prediction of effector g11335

2.2.4 效應(yīng)蛋白g11335跨膜區(qū)分析 效應(yīng)蛋白g11335跨膜區(qū)分析，通過(guò)對(duì)跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在g11335效應(yīng)蛋白質(zhì)的全部462個(gè)氨基酸中，無(wú)跨膜區(qū)，如圖5所顯示。

圖5 效應(yīng)蛋白g11335的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig. 5 Prediction of transmembrane region of effector g11335

2.2.5 效應(yīng)蛋白g11335二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 效應(yīng)蛋白g11335二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該氨基酸具有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲。其中，有51個(gè)氨基酸形成α-螺旋占11.04%，115個(gè)氨基酸形成延伸鏈，占24.89%；30個(gè)氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角，占6.49%；266個(gè)氨基酸形成不規(guī)則卷曲，占57.58%，如圖6所顯示。

圖6 效應(yīng)蛋白g11335的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 6 Secondary structure of effector g11335

2.2.6 效應(yīng)蛋白g11335三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 為了解g11335蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用Swiss Model軟件對(duì)其進(jìn)行同源建模。以6ilq.1.A蛋白質(zhì)為模板，6ilq.1.A蛋白質(zhì)與效應(yīng)蛋白g11335的同源相似度為31.44%。6ilq.1.A蛋白質(zhì)為可溶性奎諾蛋白葡萄糖脫氫酶，具有里氏木霉糖活性酶家族AA12的碘化結(jié)構(gòu)。以6ilq.1.A蛋白質(zhì)為模板預(yù)測(cè)分析獲得效應(yīng)蛋白g11335三維效果圖，如圖7所示。

圖7 效應(yīng)蛋白g11335的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 7 Tertiary structure prediction of effector g11335

2.3 效應(yīng)蛋白g11335亞細(xì)胞定位及熒光觀察

利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照pBin空載體在本氏煙的細(xì)胞膜和細(xì)胞核都有表達(dá)，效應(yīng)蛋白g11335定位在本氏煙的細(xì)胞膜上。說(shuō)明g11335效應(yīng)蛋白大部分表達(dá)于細(xì)胞膜，如圖8所示。

圖8 效應(yīng)蛋白g11335亞細(xì)胞定位圖Fig. 8 Subcellular localization of effector g11335

2.4 效應(yīng)蛋白g11335煙草毒性驗(yàn)證

煙草毒性驗(yàn)證結(jié)果顯示，效應(yīng)蛋白g11335不能夠抑制由Bax引起的煙草壞死癥狀。結(jié)果說(shuō)明效應(yīng)蛋白g11335無(wú)毒性。如圖9。

圖9 效應(yīng)蛋白g11335的毒性驗(yàn)證Fig. 9 Toxicity validation of effector g11335

3 討論

小麥矮腥黑粉菌所誘發(fā)的小麥矮腥黑穗病，被認(rèn)為是對(duì)小麥的威脅最大、最難以預(yù)防的檢疫性病害之一［10-11］。在環(huán)境條件適宜且存在大量感病植株時(shí)，該病害可導(dǎo)致50%-80%的小麥生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失，甚至絕收［12］。

TCK侵染小麥之后使小麥分蘗增多，植株矮化。并且小麥的整個(gè)麥粒都變成了充滿黑粉孢子的TCK黑粉菌癭，使小麥損失嚴(yán)重［13］。該病害流行年份，發(fā)病率大約相當(dāng)于產(chǎn)量減產(chǎn)率［14］。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)西北部蒙大拿州的部分地方TCK發(fā)病率高達(dá)20%，而產(chǎn)量虧損則為45%［15］。其威力不可小覷。該病害在我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明，我國(guó)19.3%的冬小麥種植區(qū)都屬于高危險(xiǎn)區(qū)，具有適宜于TCK擴(kuò)散生長(zhǎng)的自然環(huán)境條件［16］，所以TCK一旦不能及時(shí)控制，就會(huì)威脅到我國(guó)的糧食生產(chǎn)，也將對(duì)我國(guó)的食品安全甚至是國(guó)民生活造成難以想象的危害。所以有必要加大對(duì)TCK生物特征、為害規(guī)律和防治技術(shù)的深入研究，對(duì)TCK實(shí)施早期預(yù)防和檢疫監(jiān)測(cè)，從而能夠更加全面的對(duì)其進(jìn)行防治。為我國(guó)的TCK防控工作提供技術(shù)儲(chǔ)備。

由于效應(yīng)蛋白是病原菌與植物之間的重要武器，在病原菌感染植物的整個(gè)過(guò)程中起著重要的作用，對(duì)小麥矮腥黑粉菌效應(yīng)蛋白的研究有助于闡明小麥與小麥矮腥黑粉菌之間的互作機(jī)理。本研究成功的從TCK基因組中克隆出了編碼效應(yīng)蛋白的基因g11335，該基因長(zhǎng)度為1 389 bp，編碼462個(gè)氨基酸，且該基因編碼的效應(yīng)蛋白g11335包含了GSDH super家族的功能保守域cl26817，屬于GSDH 家族的葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶，該家族的相似家族UGDH家族和CbGDH家族，皆具有家族成員影響植物體的報(bào)道。

在對(duì)基因功能的研究中表明，亞細(xì)胞定位和基因功能之間存在著密切聯(lián)系，蛋白質(zhì)處在不同的細(xì)胞部位中，其執(zhí)行的功能也就有所變化［17］。本研究結(jié)合EGFP即增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein）在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)［17-18］對(duì)g11335基因及其編碼的效應(yīng)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)定在了本氏煙的細(xì)胞膜上，因此推測(cè)它主要在細(xì)胞膜上行使功能。研究表明，細(xì)胞膜在細(xì)胞轉(zhuǎn)換物質(zhì)、吸取營(yíng)養(yǎng)、清除代謝垃圾、產(chǎn)生和運(yùn)送蛋白質(zhì)等各種處理過(guò)程中都起到著非常關(guān)鍵的功能［19-20］。對(duì)效應(yīng)蛋白g11335進(jìn)行了煙草毒性分析，結(jié)果顯示該效應(yīng)蛋白無(wú)毒性。這表明GSDH家族的成員葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶很可能并不會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生毒性影響。

本文成功克隆出TCK編碼效應(yīng)蛋白的g11335基因，并基于基因克隆和煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)對(duì)該蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位觀察以及煙草毒性驗(yàn)證，得出該效應(yīng)蛋白對(duì)本氏煙草植物體無(wú)毒性。本研究成果為進(jìn)一步深入分析基因g11335及編碼的效應(yīng)蛋白在小麥矮腥黑粉菌中的具體功能，以及其GSDH家族成員能否影響植物體的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

小麥矮腥黑粉菌基因g11335全長(zhǎng)1 389 bp，共編碼462個(gè)氨基酸。其所編碼的效應(yīng)蛋白質(zhì)具有一個(gè)跨膜區(qū)，包含典型GSDH家族結(jié)構(gòu)域，該家族成員可能是葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶，具有β螺旋折疊。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)是34.17，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為75.22，而總平均親水性則為-0.333，是偏親水蛋白質(zhì)。效應(yīng)蛋白g11335定位在本氏煙的細(xì)胞膜中，無(wú)毒性。