抗除草劑大豆GE-J12實時熒光定量PCR檢測方法的建立

曹英芳 趙新 劉雙 李瑞環 劉娜 徐石勇 高芳瑞 馬卉蘭青闊 檀建新 王永

（1.河北農業大學食品科技學院，保定 071001；2.天津農業科學院種質資源與生物技術研究所，天津 300381；3.安徽省農業科學院水稻研究所，合肥 230041）

大豆是一種理想的優質植物蛋白食物［1］，是食品和飼料中蛋白質的重要來源［2-3］，在我國膳食結構［4］中占有重要地位。近年來，全球大豆的需求量呈上升趨勢［5］，預計未來大豆需求量將持續上升。我國轉基因大豆研發起步較晚，但其種植面積約占總轉基因作物種植面積的50%［6-7］，發展前景巨大。轉基因產品的研究與產業化是農業科學技術高速發展的重要組成部分［8］，隨著轉基因技術的飛速發展［9-10］，轉基因作物及其衍生食品的安全問題［11-12］受到人們的關注。我國建立了符合國情并與國際接軌的農業轉基因生物安全標準體系［13］，對轉基因實施定量標識管理制度，為我國農業轉基因生物安全管理提供了有力的技術保障［14］，因此亟需建立快速、精準的轉基因成分定量檢測方法。

目前國內外轉基因食品檢測技術主要以蛋白質和核酸檢測為主。蛋白質在加工中易喪失抗原活性，所以蛋白質檢測方法對于轉基因初產品較為適用。以核酸檢測為主的環介導等溫擴增技術引物的設計要求較高，耗材昂貴；普通PCR技術只能定性檢測轉基因食品；數字PCR技術耗材昂貴；基因芯片技術成本高、數據分析復雜；而實時熒光PCR技術可用于轉基因食品檢測的定性或定量檢測，具有快速、靈敏、準確、污染少等優點，且在轉基因產品檢測上已得到廣泛應用。熒光PCR技術是在聚合酶鏈式反應技術的反應體系中加入熒光物質［15］，通過采集到的熒光信號與拷貝數關系［16］，生成可視化的曲線，實時監測整個反應過程［17］，實現了從定性到定量的飛躍［18］。本研究采用的TaqMan水解探針法，與普通PCR技術相比，該方法主要用作轉基因檢測的定量分析，從而來確定基因轉錄水平，也可用作轉基因檢測的定性分析［19］。根據轉化體和內標基因特異性序列設計引物和TaqMan探針，對標準品和試樣同時進行實時熒光PCR擴增。根據標準樣品模板拷貝數與Ct值之間的線性關系，分別繪制轉化體和內標基因的標準曲線。通過轉化體和內標基因拷貝數比值確定轉基因含量。

GE-J12是中國農業科學院研發的轉G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草劑轉基因大豆新品系，對除草劑草甘膦具有較高的耐受性。目前，國內外還未見到抗除草劑大豆GE-J12的實時熒光定量PCR的定量檢測。本研究根據抗除草劑大豆GE-J12品系外源基因插入位點5'端轉化體特異性序列設計引物和探針，經特異性、準確度、精密度和重復性測試，確定方法的檢測極限和定量極限，以期建立轉G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草劑大豆GE-J12品系的定量檢測方法，為農業轉基因生物安全評價和產權保護提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗所用轉G2-EPSPS基因和GAT基因抗除草劑大豆GE-J12及其受體材料Jack由中國農業科學院提供；其他轉基因大豆、轉基因玉米、轉基因油菜、轉基因水稻、轉基因棉花、其他非轉基因大豆混樣均購置于農業農村部科技發展中心。

1.1.2 主要試劑 TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；TaKaRa 2×Premix Ex Taq（probe q PCR），購自TaKaRa；其他試劑（分析純），購自TaKaRa。

1.1.3 儀器設備 BIO-RAD CFX96實時熒光PCR儀，購自BIO-RAD；ND-1000紫外可見分光光度儀，購自基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 隨機取GE-J12和受體Jack的種子各100粒，研磨混勻，取100-200 mg，應用TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。獲得的基因組DNA，經ND-1000紫外可見分光光度儀，檢測DNA質量，所有基因組DNA的OD260/OD280在1.8-2.0之間，濃度在50 ng/μL-100 ng/μL 之間。

1.2.2 引物設計 根據抗除草劑大豆GE-J12品系外源基因插入位點5'端轉化體特異性序列設計引物和探針，具體信息見表1，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes used in this study

1.2.3 特異性檢驗 分別以1.1.1中材料提取并稀釋到25 ng/μL的DNA為模板，應用實時熒光PCR常用反應體系和程序，對設計的引物探針進行實時熒光PCR擴增，每個反應設置3個平行，測試引物探針特異性。

1.2.4 引物濃度和體系反應程序優化 設置52、54、56、58、60和 62℃共 6個退火溫度和 0.10、0.20、0.25、0.30、0.40和0.50 μmol/L共6個引物濃度，進行實時熒光PCR擴增，選擇擴增曲線峰型成“S”型且擴增效率較高的曲線，確定退火溫度和引物濃度。

1.2.5 標準曲線構建 將提取的轉基因大豆GE-J12基因組DNA（25 ng/μL）稀釋至20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.006 4%進行PCR擴增。利用7個濃度梯度的DNA（含100%）為模板進行實時熒光PCR擴增，構建轉基因大豆GE-J12特異性序列標準曲線，以實現對轉基因大豆GE-J12的相對定量分析。

1.2.6 準確度、精確度和重復性測試 GE-J12大豆和其受體材料粉末按照5%、3%、1%的質量百分比進行混合，采用 1.2.4中建立的優化后的反應體系和程序進行實時熒光定量PCR檢測。每次設3個平行，通過多次測試的測量值與真實值之間符合程度和測量值之間的符合程度，評價測試方法的準確度和精確度。

1.2.7 檢測極限和定量極限測試 根據農業部2259號公告-5-2015的規定，轉基因檢測方法的檢測極限（LOD）應不高于目標濃度的1/20，定量極限（LOQ）應不高于目標濃度的1/10。根據1.2.5中的擴增結果數據分析得出LOD和LOQ。

2 結果

2.1 特異性測試

只有以GE-J12 DNA為模板時，出現典型擴增曲線，以大豆受體Jack、其他轉基因大豆、轉基因玉米、轉基因油菜、轉基因水稻、轉基因棉花和其他非轉基因大豆混樣為模板時，均未出現典型擴增曲線，如圖1，表明本檢測方法的特異性良好。

圖1 實時熒光定量PCR特異性檢測結果Fig.1 Specific detection results via real-time fluorescence quantitative PCR

2.2 引物濃度和體系反應程序優化

退火溫度在58℃條件下，擴增曲線呈“S”型，熒光信號值最高，確定退火溫度為58℃，如圖2。圖中3號和4號的擴增曲線Ct＜36，根據經濟原則選擇3號，確定引物和探針終濃度分別為0.5 μmol/L和 0.25 μmol/L。

圖2 實時熒光定量PCR體系優化結果Fig.2 Optimization results of real-time fluorescent quantitative PCR system

2.3 標準曲線構建及線性度

本方法在模板含量為0.006 4%-100%范圍內線性度為0.992，擴增效率為101.5%，如圖3。

圖3 標準曲線建立Fig.3 Standard curve establishment

2.4 準確度、精確度和重復性測試

通過轉基因大豆GE-J12轉化體特異性序列和內源基因Lectin的拷貝數的lg值的比值，對5%、3%和1%樣品進行定值，測試結果與真實值平均偏差為2.87%、6.87%、16.67%，均≤25%，符合定量方法建立要求，具體結果如表2。

表2 樣品定值結果Table 2 Results of sample setting

2.5 定量限和檢出限測試

以模板含量為0.032%和0.006 4%擴增時，均有典型擴增曲線，其中模板含量為0.006 4%時，18次擴增有14次出現擴增曲線。所以采用0.032%模板含量，進行了60次重復試驗，Ct值的平均值為34.95，最大值為35.50，最小值為34.40，確定本檢測方法的檢出限LOD為0.032%，如圖4。

圖4 轉基因大豆GE-J12實時熒光定量PCR檢出限測試Fig.4 Detection limit via real-time fluorescence quantitative PCR for genetically modified soybean GE-J12

分別以0.16%和0.032%的DNA為模板，進行了3次重復擴增試驗，SD值分別為0.14-0.20和0.37-0.67，RSD值分別為0.43%-0.59%和1.04%-1.89%，隨著模板濃度的降低，擴增結果Ct值的SD和RSD增大。確定本檢測方法的定量限LOQ為0.16%，具體結果如表3。

表3 實時熒光定量PCR靈敏度及可重復性測試Table 3 Sensitivity and repeatability test of real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

一般通過檢測外源基因，判斷其是否為轉基因食品。目前，普通PCR技術可用于轉基因定性檢測，實時熒光定量PCR技術可用于轉基因定量及定性檢測，數字PCR技術可用于轉基因檢測的定量檢測。李瑞環等［20］建立了轉基因耐除草劑大豆ZH10-6多重PCR檢測方法，該方法易造成交叉污染、假陽性，并且存在靈敏度不高、操作繁瑣和特異性低、耗時耗資、不能定量檢測等缺點。冀志庚等［21］采用SYBR Green實時定量PCR技術檢測轉基因大豆中外源基因拷貝數，該方法不具有特異性，反應中的引物二聚體或非特異性擴增也會發生熒光。邢珍娟等［22］建立了二重熒光PCR檢測轉基因成分方法用于轉基因成分篩查；汪小福等［23］建立的實時熒光PCR技術對轉基因玉米進行檢測，均為基于TaqMan探針法的實時熒光PCR技術，該技術特異性強、靈敏度高，操作簡便，能夠克服普通PCR的缺點，實現對轉基因成分的定量分析。

通過對多重PCR技術、SYBR Green實時定量PCR技術和TaqMan探針法的實時熒光PCR技術比較發現，最后一種方法對轉基因檢測更適合，且在轉基因定量檢測中應用廣泛。實時熒光PCR技術和數字PCR方法是目前被國際認可的主要轉基因成分定量檢測方法。Ko?ir等［24］對大豆內標基因和外源基因建立數字PCR技術進行單重和雙重方法。本研究后續針對轉基因大豆GE-J12將建立基于數字PCR技術的絕對定量，此技術可實現絕對定量，具有更高的靈敏度，無需標準品，不需要通過建立標準曲線來定量，操作更加簡便，應用前景廣泛。

轉基因大豆GE-J12是中國農業科學院研發的轉基因大豆新品系。當前國內外文獻還未見到抗除草劑大豆GE-J12的實時熒光定量PCR的定量檢測。本研究采用的基于TaqMan探針法的實時熒光PCR技術對轉基因大豆GE-J12進行定量檢測，試驗結果均符合2259號公告-5-2015的規定。該方法可用于轉基因耐除草劑大豆GE-J12轉化體特異性序列含量的精準定量，為大豆GE-J12的檢測提供了新方法；為該轉基因大豆品系商品化后，轉化體的安全評價、行政監管和知識產權保護提供重要的技術支撐。

4 結論

本研究建立了基于TaqMan法的轉基因大豆GEJ12實時熒光定量PCR檢測方法，確定了上、下游引物和探針的濃度分別為0.5 μmol/L、0.5 μmol/L和0.25 μmol/L，退火溫度為58℃，在RSD小于25%的情況下檢出限為0.032%，定量限為0.16%，線性度為0.992。