m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在牛脂肪生成中的表達分析

楊昕冉 王建芳 馬鑫浩 昝林森，2

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100；2.國家肉牛改良中心，楊凌 712100）

牛肉因其高蛋白、低膽固醇，且富含人體需要氨基酸，越來越受到人們的青睞，但我國肉牛仍存在良種率偏低、產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)差等問題。秦川牛作為我國地方良種黃牛，個體抗逆性好、耐粗飼、具有被開發(fā)和培育成生產(chǎn)高品質(zhì)牛肉的專門化肉牛品種的潛力［1］。如何進一步利用我國以秦川牛為代表的地方黃牛優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，提高牛肉品質(zhì)，是我國肉牛產(chǎn)業(yè)亟待解決的科學問題。

許多研究表明肌內(nèi)脂肪的分布和含量決定了大理石花紋豐度——衡量牛肉品質(zhì)的重要指標。動物體內(nèi)脂肪的沉積和脂質(zhì)的合成主要是由脂肪細胞數(shù)量增多（前體脂肪細胞的增殖）、體積增大（脂肪細胞分化、甘油三酯積累、脂滴增大）和成熟來決定［2］。前體脂肪細胞的增殖和分化除了受到一系列特定且關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外［3］，還受到如DNA甲基化［4］、組蛋白修飾［5］等表觀遺傳的調(diào)控。而RNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）作為近幾年的研究熱點，其對脂肪發(fā)育的重要調(diào)控作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。作為mRNA中最常見的甲基化修飾，m6A修飾被證明具有動態(tài)可逆性，主要由包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白 14（methyltransferase 14，METTL14）［6］和腎細胞瘤 1-結(jié)合蛋白（Wilms’ Tumor 1-Associating Protein，WTAP）［7］等組成甲基轉(zhuǎn)移酶復合物催化RNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾，同時脂肪量與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）［8］和 Alk B同源蛋白 5（AlkB Homolog 5，ALKBH5）［9］等去甲基化酶可以對已發(fā)生m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾。

越來越多的證據(jù)表明m6A修飾通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNA的穩(wěn)定性、定位、運輸、剪切和翻譯進而在調(diào)控細胞命運、細胞周期、胚胎干細胞重編程、個體發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的生物學功能［10-13］。近年來，m6A在脂肪生成中的調(diào)控作用也不斷被發(fā)現(xiàn)，在FTO被發(fā)現(xiàn)可作為重要的肥胖候選基因后［14］，更多研究發(fā)現(xiàn)FTO可通過調(diào)控靶基因m6A的水平影響可變剪切、自噬通路、有絲分裂的克隆擴增等生物學過程進而促進脂肪生成［15-17］。METTL3可以通過促進CCNA2、FASN、JAK1等基因mRNA的m6A修飾調(diào)控脂肪生成［18-20］，近期研究還發(fā)現(xiàn)了METTL3對小鼠棕色脂肪的生成至關(guān)重要［21］。此外，國內(nèi)陸續(xù)在豬、雞等畜禽動物中發(fā)表了脂肪組織發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組水平的m6A甲基化修飾圖譜，揭示m6A在畜禽脂肪生成和沉積中的潛在作用［22-23］。但m6A甲基化修飾對牛脂肪發(fā)育和脂質(zhì)合成的研究鮮見報道，同時其在體外調(diào)控前體脂肪細胞增殖與分化的功能和機制仍不明確。

本研究分析METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5等m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在秦川肉牛體內(nèi)不同組織以及在體外前體脂肪細胞增殖、分化過程中的表達模式。一方面為秦川肉牛的遺傳改良和分子育種提供理論依據(jù)，另一方面從新的表觀遺傳修飾角度研究RNA甲基化對脂生成的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用牛只為西北農(nóng)林科技大學國家肉牛改良中心良種繁育場培育的秦川肉牛，分別選取3頭身體健康、狀態(tài)良好的新生（1日齡）和成年秦川肉牛（36月齡），分別采集其心、肝、脾、腎、背最長肌、前腿肌、后腿肌和脂肪組織樣品，置于-80℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 前體脂肪細胞分離、培養(yǎng)與分化 從上述新生秦川肉牛腎周脂肪中分離前體脂肪細胞。取脂肪組織剪碎，加入等體積的I型膠原酶，37℃消化60 min，加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）終止消化，依次過100 μm和40 μm的細胞篩，濾液在1 500 r/min、4℃下離心10 min，收集沉淀且重懸于完全培養(yǎng)基中，吹打均勻后接種于細胞培養(yǎng)瓶。細胞生長至80%-100%密度時，進行傳代培養(yǎng)，將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板。待細胞長滿時，將含有10%FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基換成含有10%FBS、0.01%地塞米松、0.3% 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1%胰島素和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，誘導成脂分化。2 d后換成含有10%FBS、1%胰島素和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，維持成脂分化，每2 d進行一次換液。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 使用Trizol法提取組織和細胞中的總RNA，通過酶標儀檢測RNA的純度和濃度，放于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肞rimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中去除DNA反應體系為：依次加入2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、1 000 ng總RNA，RNase-free ddH2O補足 10 μL，42℃反應2 min。反轉(zhuǎn)錄反應體系為：在上述反應液中依次 加 入 4.0 μL 5×PrimeScript Buffer、4.0 μL RNasefree dH2O、1.0 μL RT Primer Mix 和 1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix， 共 計 20 μL，37℃ 反 應 15 min，85℃中15 s終止反應。cDNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）（TaKaRa，大連）熒光定量試劑盒進行RT-qPCR。15 μL的反應 體 系 為 ：7.5 μL TB Green Premix Ex Taq（2×）、各0.5 μL的上下游引物、1.5 μL cDNA模板（10倍稀釋）和 5.0 μL RNase-free H2O，95℃ 30 s，95℃ 3 s、60℃ 30 s、40個循環(huán)。使用GAPDH（組織表達譜使用）或β-actin（細胞試驗使用）為內(nèi)參基因，每個樣品均設置至少3個生物學重復，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。RT-qPCR所用的引物見表1。

表1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.4 油紅O染色 油紅O工作液配制：0.5 g油紅O染料溶于100 mL異丙醇后為油紅O原液，將原液與ddH2O按3∶2混合，過濾后為油紅O工作液。染色：棄去細胞培養(yǎng)基并用PBS漂洗細胞3遍，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min。棄去固定液再用PBS漂洗3遍，加入油紅O工作液染色30 min。棄去染液，PBS洗凈后在倒置顯微鏡下觀察并記錄脂滴形成情況。

1.2.5 統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 7.00軟件（GraphPad Software公司，美國）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并生成圖片。分別用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析（One-way ANOVA）比較兩組和多組之間的差異，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，結(jié)果以平均值±標準差來表示，每組設置至少3個生物學重復。

2 結(jié)果

2.1 m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在秦川肉牛不同組織中的表達分析

為了檢測m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在不同月齡秦川牛各組織中的表達水平，分別采集了新生牛和成年牛的心、肝、脾、腎、背最長肌、前腿肌、后腿肌和脂肪等組織。RT-qPCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在新生牛不同組織中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP和去甲基化酶FTO、ALKBH5的組織表達譜相似，均是在肝和脾中高表達，在心臟以及背最長肌、前腿肌和后腿肌等骨骼肌中低表達，而在腎和脂肪組織中的表達穩(wěn)定且水平基本一致（圖1-A-E）。在成年牛中的表達模式與新生牛不同的是，除了在肝和脾中高表達外，METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5在成年牛腎臟和脂肪組織中也表現(xiàn)出高表達水平（圖1-F-J），并且METTL3、METTL14、WTAP和FTO不管在新生牛還是在成年秦川肉牛的脂肪組織中的表達量均顯著高于肌肉組織（P＜0.05），而ALKBH5在肌肉和脂肪組織中的表達無顯著差異。

為了分析m6A甲基化酶基因在秦川牛脂肪發(fā)育中的潛在作用，進一步比較了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP和 去 甲 基 化 酶 FTO、ALKBH5在新生牛和成年牛脂肪組織中的表達差異。結(jié)果顯示，不管是甲基轉(zhuǎn)移酶還是去甲基化酶在成年牛脂肪組織中的表達量均顯著高于新生牛（P＜0.05）（圖1-K），說明m6A甲基化修飾可能對于牛的脂肪發(fā)育具有潛在且復雜的作用機制。其中，F(xiàn)TO的表達水平相對較高且表達差異最明顯，ALKBH5的表達量相對最低，暗示FTO可能在調(diào)控牛脂肪發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

圖1 m6A甲基化相關(guān)酶基因在秦川肉牛不同組織中的表達Fig.1 Expressions of m6A methylation-related genes in different tissues of Qinchuan beef cattle

2.2 秦川肉牛前體脂肪細胞的增殖檢測

為了進一步研究m6A甲基化酶基因在牛體外前體脂肪細胞中的表達模式，在新生秦川肉牛中分離了前體脂肪細胞。如圖2-A所示，將第3代前體脂肪細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)后，細胞可以正常增殖，生長狀態(tài)良好，細胞數(shù)量隨天數(shù)逐漸增多。前體脂肪細胞的生長曲線也基本呈現(xiàn)“S”型，從前期緩慢生長到中期指數(shù)增長，在第7天細胞基本長滿且達到生長平臺期（圖2-B）。這些結(jié)果表明本研究分離的前體脂肪細胞具有正常生長增殖的能力。

圖2 秦川肉牛前體脂肪細胞的形態(tài)與生長曲線Fig.2 Morphology and growth curve of preadipocytes from Qinchuan beef cattle in vitro

2.3 秦川肉牛前體脂肪細胞的成脂分化

待前體脂肪細胞長滿后誘導成脂分化，并使用油紅O進行脂滴染色。結(jié)果如圖3-A所示，在誘導分化第3天時，圍繞細胞核成簇分布的小脂滴開始出現(xiàn)。而后隨著誘導時間延長，脂滴增多且逐漸融合形成大脂滴。同時提取了前體脂肪細胞分化第0、3、6、9、12天的總RNA，對調(diào)控成脂的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子——過氧化物酶體增生因子激活受體γ（PPARγ）、CCAAT 增強子結(jié)合蛋白 α（C/EBPα）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）以及參與脂肪合成代謝的基因——脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）進行了RT-qPCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與成脂分化早期的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα的表達在第3天顯著上升，隨后下降（P＜0.05）（圖3-B）。而在成脂分化中后期發(fā)揮調(diào)控作用的C/EBPβ的表達在分化前期逐漸上升，分化后期有所下降但仍維持較高表達水平（圖3-B）。FABP4的表達則隨著成脂分化的進行而不斷增加（圖3-B）。這些成脂分化標志基因在牛前體脂肪細胞分化的時序表達趨勢以及脂滴的形成與脂肪細胞成脂分化的一般規(guī)律相符。這些結(jié)果表明本試驗分離的牛前體脂肪細胞具有正常的成脂分化能力，可以進行后續(xù)試驗研究。

圖3 秦川肉牛前體脂肪細胞成脂分化檢測Fig.3 Detection of preadipocytes adipogenic differentiation in Qinchuan beef cattle

2.4 m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在前體脂肪細胞增殖過程中的時序表達譜

對5個m6A甲基化酶基因在牛前體脂肪細胞增殖期的不同時間點（第1、2、3、4、5、6、7天）進行了相對表達量檢測，結(jié)果如圖4所示。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達量在增殖前期逐漸降低，METTL14、WTAP也均與之一樣在第3天達到最低表達量，且在第4天有所上升，但僅維持較低的表達水平。而m6A去甲基化酶FTO在增殖前期基本無變化，隨后呈緩慢上升趨勢（P＜0.01）；另一個m6A去甲基化酶ALKBH5的表達先升高后下降（P＜0.01），在增殖中后期不斷升高（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和WTAP可能在牛前體脂肪細胞增殖前期具有潛在的調(diào)控作用，而m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5可能在增殖中后期發(fā)揮作用。

圖4 m6A甲基化相關(guān)基因在前體脂肪細胞增殖過程中的時序表達譜Fig.4 Temporal expression profile of m6A methylationrelated genes during preadipocytes proliferation

2.5 m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因在前體脂肪細胞分化過程中的時序表達譜

同樣地，使用RT-qPCR檢測了5個基因在牛前體脂肪細胞成脂分化不同時間點（第0、3、6、9、12天）的時序表達模式。結(jié)果如圖5所示，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO的表達趨勢基本一致，均在分化前期下降（P＜0.01），在第6天上升至高表達（P＜0.01），隨后又逐漸降低。而WTAP與ALKBH5的表達變化相似，前期維持穩(wěn)定表達，在第6天表達顯著增加且隨后繼續(xù)維持高表達水平至分化晚期第12天。這些結(jié)果暗示這些m6A甲基化修飾相關(guān)酶基因可能具有潛在的調(diào)控牛前體脂肪細胞分化、影響脂肪生成的功能。

圖5 m6A甲基化相關(guān)基因在前體脂肪細胞分化過程中的時序表達譜Fig.5 Temporal expression profile of m6A methylationrelated genes during preadipocytes differentiation

3 討論

盡管m6A甲基化修飾早在20世紀70年代就被發(fā)現(xiàn)［24］，但因為過去實驗技術(shù)方法的限制，一直沒能引起人們的重視。而隨著m6A甲基化修飾動態(tài)可逆模式［8］和高通量測序技術(shù)［25-26］的發(fā)展，m6A修飾發(fā)揮的生物學功能不斷被揭示，RNA甲基化研究也成為近十年的研究熱點。m6A已被發(fā)現(xiàn)可影響如多種癌癥細胞增殖轉(zhuǎn)移、胚胎干細胞分化、細胞命運決定等多個生物學過程［27-30］。近年來，m6A在畜禽肌肉和脂肪發(fā)育中的修飾模式和潛在作用也不斷被發(fā)現(xiàn)［21-23，31-34］。但m6A修飾在牛體內(nèi)和體外脂肪發(fā)育方面研究仍未見報道，而我國本地黃牛品種的脂肪沉積能力較國外優(yōu)良肉牛品種仍有一定差距，國內(nèi)肉牛行業(yè)仍需圍繞促進牛肉脂肪沉積，增加大理石花紋，提高牛肉品質(zhì)等方面開展科研創(chuàng)新。本研究選用國內(nèi)良種黃牛——秦川肉牛為研究對象，研究m6A修飾相關(guān)甲基化酶基因METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5在秦川肉牛不同組織中的表達水平，比較其在新生牛和成年牛脂肪組織中的表達差異；并分離出具有正常增殖和成脂分化能力的前體脂肪細胞，檢測這5個基因在秦川肉牛前體脂肪細胞增殖和成脂分化過程中的表達情況。

關(guān)于m6A修飾相關(guān)基因在動物體內(nèi)不同組織中的表達研究較少，為了探究m6A修飾相關(guān)甲基化酶在牛不同組織中的表達特異性，對5個經(jīng)典的m6A甲基化酶基因進行了表達量檢測。得到的結(jié)果與朱琳娜等［35］在不同品種豬的不同組織中關(guān)于FTO和METTL3的表達研究結(jié)果一致，均是在骨骼肌中低表達，在肝臟中高表達。此外，上述研究還發(fā)現(xiàn)了FTO和METTL3在不同品種豬的脂肪組織中有著穩(wěn)定的表達，本研究結(jié)果也表明除ALKBH5外，METTL3、METTL14、WTAP和FTO在脂肪組織中的表達顯著高于肌肉組織。另一項研究表明，F(xiàn)TO在大鼠的多種組織中均有表達［36］，與本研究不同的是該研究的數(shù)據(jù)顯示FTO在大鼠骨骼肌中表達要高于脂肪組織，本研究則是發(fā)現(xiàn)FTO在牛脂肪組織中的表達量顯著高于骨骼肌。另外，馬子玉等［37］的研究發(fā)現(xiàn)METTL3在豬的不同組織和器官中廣泛表達且差異較不明顯。這些不同結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于品種間的差異所致。此外，這5個基因在牛的肝臟中均有明顯的高表達水平，暗示m6A修飾可能對牛肝臟功能的調(diào)控具有潛在作用，多個研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在肝臟疾病中發(fā)揮重要作用也支持此推論［38-39］。再綜合這5個基因在成年牛脂肪組織中高表達的結(jié)果，表明m6A修飾相關(guān)酶基因與牛脂肪沉積、代謝和發(fā)育性能密切相關(guān)。

在體外研究脂肪細胞的功能可以便于更好地理解脂肪生成的分子機制。根據(jù)脂肪細胞分化過程中的變化一般將脂肪細胞分為：脂肪母細胞、脂肪前體細胞、前脂肪細胞和成熟的脂肪細胞［40-41］，其中前體脂肪細胞是脂肪組織基本的生物學單位，其增殖分化能力的持續(xù)發(fā)生伴隨著動物的一生［41］，而脂肪的沉積主要由前體脂肪細胞的增殖和分化決定。為了進一步研究m6A對脂肪生成的作用，試驗分離了秦川肉牛的前體脂肪細胞，并鑒定了其具有正常增殖和成脂分化的能力，進而在體外開展上述5個基因在前體脂肪細胞增殖和分化中的表達分析。已有研究發(fā)現(xiàn)敲低m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶復合物METTL3/METTL14/WTAP中的任意一種都會通過降低CCNA2的表達進而抑制細胞周期，減弱脂肪生成［18］。另外，METTL3、METTL14和WTAP被發(fā)現(xiàn)促進心肌細胞、平滑肌細胞以及多種癌細胞等的增殖［42-48］。本研究的增殖時序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METTL3、METTL14和WTAP均在增殖前期表達下降，增殖中后期表達恢復，說明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶可能也參與調(diào)控牛前體脂肪細胞的增殖。與甲基轉(zhuǎn)移酶的作用相對地，m6A去甲基化酶FTO被發(fā)現(xiàn)抑制白血病細胞的增殖［49］，ALKBH5可抑制干細胞以及腫瘤細胞的增殖［50-51］。此外，在脂肪生成方面，有研究發(fā)現(xiàn)FTO沉默推遲細胞周期的進程，抑制脂肪形成［17，52］。任倩等［53］的研究表明 FTO 可通過抑制線粒體UPR來緩解小鼠脂肪細胞的凋亡。綜合本研究發(fā)現(xiàn)的FTO和ALKBH5在牛前體脂肪細胞增殖時序中的表達水平變化明顯且與甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達模式明顯不同的結(jié)果，可以推斷這5個m6A修飾相關(guān)酶基因可能通過發(fā)揮其調(diào)控m6A甲基化修飾的作用來參與牛前體脂肪細胞的增殖過程。

脂肪生成除了受前體脂肪細胞的增殖影響外，成脂分化中脂滴的形成和脂肪酸合成與代謝更是起到?jīng)Q定性作用。近年來，關(guān)于m6A修飾在畜禽脂肪生成和沉積中的作用機制研究逐漸增多，但主要圍繞m6A修飾的兩個明星酶基因——METTL3和FTO展開。中科院楊運桂課題組最早發(fā)現(xiàn)FTO的m6A去甲基化作用是脂肪生成必需的［15］。其他研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)FTO可以通過調(diào)控自噬［16］、線粒體DNA含量［54］等促進小鼠脂肪積累。在畜禽動物中的研究，Jia等［55］在雞脂肪中的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO通過介導m6A去甲基化，促進與脂質(zhì)合成相關(guān)的基因表達進而增加甘油三酯（TG）的積累。浙江大學汪以真課題組近些年來圍繞METTL3和FTO調(diào)控豬脂肪沉積方面的一系列研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO通過負調(diào)控豬脂肪細胞m6A水平，正調(diào)控脂肪沉積［35，56-57］；而METTL3通過正調(diào)控m6A甲基化水平，抑制豬脂肪沉積［20，35］。他們的研究中還發(fā)現(xiàn)了METTL3和FTO在豬脂肪細胞分化前期增加而中后期下降［35］，這與本研究的結(jié)果一致，暗示著METTL3和FTO也對牛的脂肪發(fā)育可能具有重要調(diào)控作用。與上述研究不同，在奶牛乳腺上皮細胞中的研究發(fā)現(xiàn)METTL3正調(diào)控乳脂的合成［58］，還有其他研究發(fā)現(xiàn)METTL3通過提高靶基因的m6A水平介導其表達進而正調(diào)控脂質(zhì)合成與代謝［19，59］。這些結(jié)果不同的研究表明了在不同物種中METTL3和FTO調(diào)控脂肪生成的作用和機制可能是復雜且存在差異的。此外，與我們的結(jié)果不同，有研究發(fā)現(xiàn)FTO在人皮下前體脂肪細胞分化過程中表達下降［60］，而另一項研究卻發(fā)現(xiàn)FTO在人皮下脂肪細胞以及人脂肪細胞株（SGBS）分化中的表達無明顯變化［61］。造成這些不同結(jié)果的原因可能是動物品種、細胞來源以及成脂誘導方法的不同導致的。另外3個基因——METTL14、WTAP和ALKBH5在牛前體脂肪細胞分化中表達模式基本一致，都是在分化中期顯著上升，而后維持高表達水平，這與脂滴的形成過程呈正相關(guān)，暗示其可能正向調(diào)控成脂分化。也有研究發(fā)現(xiàn)了METTL14促進胚胎干細胞分化［30］和脂肪生成［18］。而關(guān)于WTAP和ALKBH5在脂肪生成中的研究較少。本研究揭示了METTL3、METTL14、WTAP、FTO和 ALKBH5在 牛脂肪發(fā)育和脂生成中可能發(fā)揮的潛在作用，后續(xù)還需進一步的試驗來探究并驗證m6A甲基化修飾以及甲基化酶基因?qū)εＶ旧傻淖饔煤头肿訖C制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP，以及m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5，均在成年秦川肉牛體內(nèi)脂肪組織中的表達均顯著高于新生牛，在體外前體脂肪細胞增殖和分化過程中的時序表達也都有著明顯的差異表達，表明m6A修飾在牛脂肪發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用且這5個m6A甲基化酶具有調(diào)控牛前體脂肪細胞增殖和分化的潛在作用。