小麥組蛋白甲基化酶在雜交種中干旱脅迫表達(dá)模式分析

陳佳敏 劉永杰 馬錦繡 李丹 公杰 趙昌平 耿洪偉 高世慶

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所，北京 100097）

表觀遺傳修飾由DNA甲基化、非編碼RNA、染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾組成，對(duì)植物發(fā)育、脅迫相關(guān)基因的表達(dá)具有重要調(diào)控作用［1］。組蛋白修飾主要發(fā)生在組蛋白尾部和核心區(qū)的殘基上，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化等修飾［2-3］，這些修飾共同構(gòu)成“組蛋白密碼”，并作用于染色質(zhì)修飾過(guò)程［4-5］。組蛋白甲基化（histone methylation，HMT）主要發(fā)生在組蛋白賴氨酸或精氨酸殘基上，根據(jù)作用位點(diǎn)和底物的不同可以分為賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine methyltransferases，HKMTs）和蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）。 賴氨酸甲基化由賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為供體將甲基轉(zhuǎn)移到賴氨酸的δ-氨基上，大多數(shù)HKMTs包含一個(gè)由130-150個(gè)氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)，即SET結(jié)構(gòu)域（用于variegation3-9的抑制因子，zeste的增強(qiáng)因子和trithorax）［6-7］。根據(jù)序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將植物SDG蛋白分為7類，分別是E（Z）同系物（H3K27）、ASH1同系物（H3K36）、Trx同系物及相關(guān)蛋白（H3K4）、含有SET和PHD結(jié)構(gòu)域的蛋白、SU（var）同系物、含中斷SET結(jié)構(gòu)域的蛋白、RBCMT和其他SET相關(guān)蛋白［8］。精氨酸甲基化由精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶以SAM為供體將甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸胍基的氮原子上。根據(jù)生化特性的不同，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可分為4類［9］：第一類PRMT修飾精氨酸側(cè)鏈的ω-N形成單甲基（monomethy-larginine，MMA）和不對(duì)稱雙甲基（asymmetric dimethylarginine，aDMA）；第 二 類PRMT修飾精氨酸側(cè)鏈的ω-N形成單甲基和對(duì)稱型雙甲基（symmetric dimethylarginine，sDMA）；第三類PRMT蛋白修飾精氨酸側(cè)鏈的ω-N僅能形成單甲基；第四類PRMT蛋白修飾精氨酸側(cè)鏈的δ-N形成單甲基［10-11］。

組蛋白甲基化在生物體細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用［12］。研究證明，組蛋白修飾通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)參與逆境脅迫［13-15］。在植物干旱脅迫中，擬南芥TRX家族中的ATX1發(fā)揮重要作用，它能使組蛋白H3在賴氨酸4上發(fā)生三甲基化（H3K4me3），參與依賴和非依賴脫落酸（ABA）途徑中脫水脅迫信號(hào)的傳遞。ATX1功能喪失導(dǎo)致植物萌發(fā)率下降，氣孔開度增大，蒸騰加快，對(duì)脫水脅迫的耐受性降低［16］。水稻SDG708直接靶向激活A(yù)BA生物合成的關(guān)鍵基因NINE-CISEPOXYCAROTENIDD3（NCED3）和 NINECIS-EPOXYCAROTENIDD5（NCED5）的表達(dá)，促進(jìn)ABA的生物合成。此外，SDG708還可誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞中過(guò)氧化氫的積累，促進(jìn)氣孔關(guān)閉以減少水分流失［17］。擬南芥SDG8功能喪失表現(xiàn)蒸騰作用加快，氣孔變大，對(duì)ABA的敏感性降低，并且對(duì)脫水脅迫的耐受性降低［18］。

干旱作為影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素之一，其對(duì)產(chǎn)量的影響超過(guò)其它因素的總和［19］。世界上約70%的小麥分布于干旱和半干旱地區(qū)［20］，小麥作為繼玉米、水稻之后的全球第三大作物［21］，提高小麥的抗旱性對(duì)國(guó)家糧食安全具有重要的意義。本研究利用生物信息學(xué)手段，對(duì)小麥組蛋白甲基化酶基因家族中受干旱脅迫誘導(dǎo)的基因進(jìn)行篩選，通過(guò)檢測(cè)其在受干旱脅迫處理的雜交組合中的表達(dá)模式，以期為組蛋白甲基化酶在二系雜交小麥抗旱性中的功能研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 以北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所提供的雜交小麥組合為實(shí)驗(yàn)材料：父本（P）09YH91-5、 母 本（M）BS278及 其 子 一 代（F1）BS278*09YH91-5。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑購(gòu)自Ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒5×ABScript III RT Mix反轉(zhuǎn)錄酶（ABclonal公司）合成cDNA，使用2×Universal SYBR Green試劑（ABclonal公司）進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，其他生化試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 小麥TaHMT基因家族干旱脅迫響應(yīng)基因篩選 為了解TaHMT基因家族干旱脅迫表達(dá)情況，將175個(gè)TaHMT基因提交到Wheat Expression Brower數(shù)據(jù)庫(kù)（http://wheat-expression.com/）和WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)（http://wheatomics.sdau.edu.cn/）獲取小麥在干旱脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用TBtools軟件繪制基因表達(dá)熱圖，篩選差異表達(dá)基因［22］。為進(jìn)一步篩選旱脅迫響應(yīng)基因，通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲取在擬南芥和水稻中已鑒定的抗旱基因并下載蛋白序列，提交到Ensemble plant網(wǎng) 站（https://plants.ensembl.org/index.html）進(jìn)行Blastp，檢索其在小麥中同源蛋白，選取相似度較高的蛋白（E-value≤1E-100），作為同源蛋白，再將同源蛋白的基因號(hào)與175個(gè)TaHMT基因進(jìn)行比較確定小麥TaHMT家族旱脅迫響應(yīng)候選基因。

1.2.2 小麥TaHMT干旱脅迫響應(yīng)候選基因理化性質(zhì)分析 從Ensembl網(wǎng)站獲取有關(guān)基因ID，物理位置，基因序列、蛋白質(zhì)序列以及編碼序列（CDS）的信息。通過(guò)在線程序Expasy（http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)TaHMT蛋白的等電點(diǎn)（pI）、分子量（Mw）、不穩(wěn)定系數(shù)以及親水指數(shù)等信息［23］。通過(guò)Cell-PLoc網(wǎng) 站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）預(yù)測(cè)每個(gè)TaHMT基因的亞細(xì)胞定位［24］。利用 Prot Scale網(wǎng) 站（https://web.expasy.org/protscale/）對(duì)TaHMT蛋白親水性和疏水性進(jìn)行分析［23］。

1.2.3 小麥TaHMT干旱脅迫候選基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 利用在線分析網(wǎng)站SOMPA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對(duì)8個(gè)TaHMT旱脅迫候選基因的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)［25］。利用在線網(wǎng)站Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測(cè)TaHMT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)［26］，并通過(guò)VMD軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.4 小麥干旱脅迫候選TaHMT基因系統(tǒng)發(fā)育與基因結(jié)構(gòu)分析 為了研究TaHMT基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，利用軟件TBtools進(jìn)行了映射［22］。利用在線工 具 MEME（http://meme-suite.org/index.html） 對(duì) 小麥TaHMT蛋白的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)（參數(shù)設(shè)置：最大基序數(shù)目=15，最佳基序?qū)挾?-50個(gè)殘基）［27］，使用TBtools導(dǎo)出相應(yīng)的可擴(kuò)展矢量圖形（SVG）［22］。

1.2.5 小麥TaHMT旱脅迫候選基因同源序列比對(duì)分析 利用Ensemble plant網(wǎng)站搜索候選基因的直系同源序列，然后用Pfam網(wǎng)站（http://pfam.xfam.org/）對(duì)同源基因蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，保留具有SET、PRMT結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。用MEGA11.0的ClustalW程序?qū)ζ胀ㄐ←湥═riticum aestivum L.）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu L.）、大麥（Hordeum vulgare L.）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii L.）、 二 粒 小 麥（Triticum dicoccoides L.）、 短 柄 草（Brachypodium distuchyon L.）、 水 稻（Oryza sativa L.）、 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana L.）8個(gè) 物 種的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)［28］，用最大似然法（maximum likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Jones Taylor Thornton 模型，Bootstrap值設(shè)為1 000。 用 Evolview2.0網(wǎng) 站（http://www.omicsclass.com/article/671）進(jìn)行可視化［29］。

1.2.6 小麥TaHMT干旱脅迫候選基因順式作用元件分析 利用TBtools軟件搜索TaHMT基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp的小麥基因組DNA序列，并用PlantCare數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)這8個(gè)基因的順式作用元件進(jìn)行分析［30］。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在田間選取生長(zhǎng)狀況一致的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期小麥，對(duì)清洗好的植株進(jìn)行干旱脅迫處理，分別在干旱0 h，3 h，6 h，24 h的時(shí)間點(diǎn)對(duì)小麥葉片進(jìn)行取樣；將大小均一、成熟且飽滿的小麥種子種在含有相同質(zhì)量的土壤的花盆中，等小麥生長(zhǎng)7 d左右時(shí)，對(duì)花盆進(jìn)行不澆水的干旱處理，注意觀察表型，對(duì)干旱處理 20 d 后的材料分別取樣，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，液氮冷凍并保存在-80℃。利用Trizol提取植物材料總RNA，使用5×ABScript III RT Mix反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)時(shí)定量PCR使用2×Universal SYBR Green試劑在Rotor-Gene 3000定量PCR儀（gene company limited）上進(jìn)行。利用Primer3.0（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)基因引物，小麥Actin基因?yàn)閮?nèi)參，每個(gè)樣品3次重復(fù)（表1）。擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃，3 min，變性95℃，5 s，退火 /延伸 60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃，15 s，55℃持續(xù)升溫到95℃。實(shí)時(shí)定量結(jié)果采用2-ΔΔCT比較定量法進(jìn)行分析，然后使用SPSS21軟件進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 小麥TaHMT基因家族干旱脅迫響應(yīng)基因的篩選

通過(guò)對(duì)小麥組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族研究，我們篩選到175個(gè)TaHMT基因。在Wheat Expression Brower數(shù) 據(jù) 庫(kù)（SRP068165） 和WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)（PRJNA306536）獲取所有基因干旱脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)（附圖1）。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析選擇脅迫處理前后差異倍數(shù)大于2的基因作為干旱響應(yīng)基因。在Wheat Expression Brower數(shù)據(jù)庫(kù)和WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)中分別篩選到24、81個(gè)干旱響應(yīng)基因。通過(guò)比較基因組學(xué)策略對(duì)擬南芥、水稻中已報(bào)道的抗旱相關(guān)組蛋白甲基化酶基因ATX1、SDG8、SDG708 同源比對(duì)［17-18，31］，篩選到 8個(gè)抗旱 候 選 基 因：TaHMT19、TaHMT21、TaHMT28、TaHMT31、TaHMT39、TaHMT42、TaHMT105、TaHMT113。在Wheat Expression Brower數(shù)據(jù)庫(kù)和WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)中有17個(gè)重疊的干旱響應(yīng)基因，WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)和同源比對(duì)基因有4個(gè)重疊的干旱響應(yīng)基因（圖1-A）。同源比對(duì)重疊的4個(gè)基因 TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT105和從17個(gè)重疊基因中選取差異倍數(shù)較大的4個(gè)基因TaHMT24、TaHMT49、TaHMT143、TaHMT157， 總共8個(gè)基因作為組蛋白甲基化干旱脅迫響應(yīng)候選基因（圖1-B、圖1-C），其中 TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42為同源基因。

圖1 小麥TaHMT候選基因干旱脅迫表達(dá)熱圖Fig.1 Heatmap of TaHMT candidate gene expressions under drought stress in wheat

2.2 小麥TaHMT干旱脅迫響應(yīng)候選基因理化性質(zhì)分析

小麥干旱脅迫響應(yīng)候選TaHMT基因分子量在42 293.23-122 007.19 kD之間，編碼蛋白由309-1 086個(gè)氨基酸組成，蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)各不相同，大部分等電點(diǎn)在7以下，偏酸性，但TaHMT49和TaHMT105的等電點(diǎn)呈弱堿性，分別為7.09和7.59。不穩(wěn)定蛋白指數(shù)介于38.91-54.59之間，大部分蛋白不穩(wěn)定指數(shù)大于40是不穩(wěn)定蛋白，但TaHMT157不穩(wěn)定指數(shù)為38.91，穩(wěn)定性較好。用Cell-PLoc預(yù)測(cè)蛋白在細(xì)胞中的位置，發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因都定位于細(xì)胞核（表2）。利用Prot Scale網(wǎng)站分析候選基因氨基酸序列的親水性和疏水性，發(fā)現(xiàn)部分蛋白的親水性和疏水性不同，其中TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42的親疏水性相同（圖2）。總體而言，TaHMT蛋白的親水氨基酸比疏水氨基酸多，表現(xiàn)為親水蛋白。

表2 TaHMT干旱脅迫候選基因基本信息Table 2 Basic informationof TaHMTdrought stress candidate genes

2.3 小麥干旱脅迫候選TaHMT基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步了解TaHMT干旱脅迫候選基因的蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)候選基因的氨基酸序列進(jìn)行二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，TaHMT蛋白均由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)元件組成，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最高，延伸鏈次之，β轉(zhuǎn)角最 少（表3）。 其中 TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT105、TaHMT143、TaHMT157蛋白無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最高達(dá)到50%左右，而TaHMT24蛋白中α螺旋所占比例最高，這可能導(dǎo)致TaHMT24與其它蛋白具有不同的功能。通過(guò)對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)（TaHMT105蛋白未知），發(fā)現(xiàn)TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，但與其他基因的蛋白結(jié)構(gòu)存在差異（附圖2）。

表3 小麥TaHMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 3 Secondary structure analysis of TaHMT proteins

圖2 TaHMT蛋白親疏水性分析Fig.2 Analyzed hydrophilicity and hydrophobicity for TaHMT protein

2.4 小麥TaHMT干旱脅迫候選基因同源蛋白序列比對(duì)

通過(guò)對(duì)普通小麥（T.aestivum L.）、烏拉爾圖小麥（T.urartu L.）、大麥（H.vulgare L.）、節(jié)節(jié)麥（A.tauschii L.）、 二 粒 小 麥（T.dicoccoides L.）、 短柄草（B.distuchyon L.）、水稻（O.sativa L.）、擬南芥（A.thaliana L.）8個(gè)物種的進(jìn)化分析（圖3），發(fā)現(xiàn)TaHMT42和TaHMT49蛋白序列與節(jié)節(jié)麥（AET-2Gv20684800.3和AET2GV21311500.2）的親緣關(guān)系最近；TaHMT24蛋白序列與水稻（Os07t0640000-01）的親緣關(guān)系較近；TaHMT31蛋白序列與二粒小麥（TRIDC2BG046490.4）的親緣關(guān)系最近；TaHMT105蛋白序列與短柄草（KQJ86923）的親緣關(guān)系較近；TaHMT21和TaHMT143分別與大麥（HORVU2Hr1G074910.1和HORVU7Hr1G086320.1） 的親緣關(guān)系最近；TaHMT157蛋白序列與烏拉爾圖小麥（TRIUR3 10876-T1）的親緣關(guān)系最近。其中TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42聚集在同一分支上，TaHMT24和TaHMT157聚集在同一分支上，它們的關(guān)系更近，可能具有相同的功能。

圖3 TaHMT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TaHMT

2.5 小麥干旱脅迫候選TaHMT基因系統(tǒng)發(fā)育與基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)TaHMT基因結(jié)構(gòu)存在較大的差異，其中TaHMT105外顯子數(shù)量最多（24個(gè)），TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42外顯子相似，TaHMT143僅有2個(gè)外顯子。利用MEME網(wǎng)站對(duì)TaHMT基因的氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析，發(fā)現(xiàn)TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42蛋白motif組成及其分布與其他基因差異較大，含有多種motif結(jié)構(gòu)；TaHMT24、TaHMT143、TaHMT157蛋白僅含有1個(gè)motif結(jié) 構(gòu)：motif10 或 motif15（ 圖4）。TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42和TaHMT49蛋白都有motif4；TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42和 TaHMT105都有motif1；TaHMT24、TaHMT105和TaHMT157都有motif15。

圖4 小麥TaHMT干旱脅迫候選基因基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析Fig.4 Gene structure and conserved motifs analysis of wheat TaHMT drought stress candidate genes

2.6 小麥TaHMT干旱脅迫候選基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

順式作用元件在植物的非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［32］。通過(guò)對(duì)TaHMT干旱脅迫候選基因啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)候選基因都含有干旱響應(yīng)相關(guān)順式作用元件如：ABRE［33］、MBS［34-35］、CGTCA-motif 和 TGACG-motif［36-38］（ 附表1）。TaHMT42只 有 TGACG-motif，CGTCA-motif兩種響應(yīng)元件；TaHMT21，TaHMT24，TaHMT49有3種響應(yīng)元件，其作用元件的種類和數(shù)目有所不同；TaHMT31，TaHMT105，TaHMT143和TaHMT157有4種旱響應(yīng)元件，但每種響應(yīng)元件的數(shù)目不同；其中TGACG-motif，CGTCA-motif兩種響應(yīng)元件是8個(gè)基因所共同擁有的（圖5）。我們推測(cè)啟動(dòng)子作用元件的不同，從而受上游調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子不同，可能是導(dǎo)致干旱脅迫下TaHMT基因表達(dá)量差異的重要原因。

圖5 TaHMT干旱脅迫候選基因干旱響應(yīng)元件種類和數(shù)目Fig.5 Types and number of drought response elements of TaHMT drought stress candidate genes

2.7 小麥TaHMT干旱脅迫下實(shí)時(shí)定量PCR分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證TaHMT基因的干旱表達(dá)模式，使用雜交組合 BS278（M）、BS278*09YH91-5（F1）、09YH91-5（P）對(duì)TaHMT基因表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR分析，其中BS278母本不抗旱，09YH91-5父本抗旱，BS278*09YH91-5和父本09YH91-5表型相似表現(xiàn)為抗旱，即在定量表達(dá)時(shí)干旱處理后BS278*09YH91-5和09YH91-5的表達(dá)應(yīng)相似，但與BS278的表達(dá)存在顯著性差異。結(jié)果顯示，TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT105、TaHMT143和 TaHMT157均受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，隨脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)（圖6-A）。其中在某一時(shí)間段，母本BS278的表達(dá)量高于父本09YH91-5和雜交種BS278*09YH91-5的表達(dá)，這可能與組蛋白甲基化酶干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)特性相關(guān)，即基因表達(dá)量越高越不抗旱。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT143 和TaHMT157定量表達(dá)結(jié)果符合雜交種及父母本的干旱表型（圖6-A）；在苗期地上部分的定量表達(dá)中 TaHMT21、TaHMT24、TaHMT42、TaHMT49和TaHMT143符合雜交種及父母本的干旱表型（圖6-B）；在苗期地下部分的定量表達(dá)中TaHMT21、TaHMT24、TaHMT42和TaHMT105符 合 雜 交 種及父母本的干旱表型（圖6-C），其中TaHMT21、TaHMT24和TaHMT42在小麥不同時(shí)期不同組織的材料中都符合雜交種及父母本的表型。因此，推測(cè)TaHMT21、TaHMT24和TaHMT42可能參與調(diào)控雜交種的抗旱性。

圖6 TaHMT干旱脅迫下的表達(dá)模式分析Fig.6 Expressions of TaHMT under drought stress

3 討論

組蛋白甲基化作為一種表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，在動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、異染色質(zhì)形成、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄激活與沉默等方面發(fā)揮著重要作用［13，39］。本研究對(duì)已鑒定的175個(gè)組蛋白甲基化酶基因家族成員通過(guò)干旱數(shù)據(jù)庫(kù)和同源序列比對(duì)共篩選到8個(gè)旱脅迫響應(yīng)候選基因。理化性質(zhì)分析發(fā) 現(xiàn) TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT143、TaHMT157都偏酸性、分子量大小相近、都位于細(xì)胞核中，推測(cè)這幾個(gè)基因的功能相似。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TaHMT蛋白結(jié)構(gòu)組成元件相同，但每種元件的比例與分布存在差異，其中TaHMT24蛋白α螺旋比例最高，可能形成某種特殊的結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的功能。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)TaHMT基因所含內(nèi)含子外顯子數(shù)目不同，但其富集區(qū)域相似；motif分析發(fā)現(xiàn)TaHMT蛋白具有不同的motif，但也具有相同的motif基序如motif1和motif15，推測(cè)這兩種motif基序可能在組蛋白甲基化酶干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)TaHMT旱脅迫候選基因都含有旱脅迫響應(yīng)元件，但元件的種類和數(shù)目不同，說(shuō)明TaHMT基因可能受到旱脅迫響應(yīng)，但每個(gè)基因受響應(yīng)的程度不同，存在表達(dá)差異。

多物種同源序列比對(duì)分析顯示：TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42 和 Os04t0429100（SDG708）聚集在同一分支，而研究發(fā)現(xiàn)水稻SDG708與ABA生物合成關(guān)鍵基因結(jié)合，增加內(nèi)源ABA含量，從而調(diào)控水稻的耐旱性［17］，由此推測(cè)TaHMT21、TaHMT31和TaHMT42參與小麥旱脅迫響應(yīng)。AT2G31650（ATX1）通過(guò)催化H3K4me3，激活A(yù)BA生物合成基因NCED3，提高擬南芥的抗旱性［16-31］。另外ATX1參與根的發(fā)育、干細(xì)胞生態(tài)維持和細(xì)胞模 式 的 形 成 過(guò) 程［40］；Os09t0134500（Ostrx1） 與開花時(shí)間調(diào)控相關(guān)［41］。因此，推測(cè)作為與ATX1、Ostrx1聚集在同一分支的TaHMT105具有提高小麥抗旱性的功能。AT5G12270（AtPRMT3）是前體RNA加工和核糖體生物合成所必需的，能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育［42］，AT5G43990（SUVR2）參與基因沉默［43-44］，作為分別和AtPRMT3、SUVR2處于同一分支的TaHMT157、TaHMT49可能具有相似的功能。

此外，本研究對(duì)TaHMT旱脅迫候選基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT105、TaHMT143 和TaHMT157基因均受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的模式，但除了在WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)中TaHMT49表現(xiàn)為先下調(diào)后上調(diào)，TaHMT143表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)外，大部分基因在Wheat Expression Brower數(shù)據(jù)庫(kù)和WheatOmics數(shù)據(jù)庫(kù)中都呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)模式，這可能是由于在不同材料中不同基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)程度不同，取樣時(shí)間不同造成的差異。在過(guò)表達(dá)的SDG708能夠增加水稻的抗旱性［17］，但與SDG708同源的TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42基因在小麥雜交組合中的表達(dá)表現(xiàn)為表達(dá)量較高的母本不抗旱，表達(dá)量較低的父本抗旱，推測(cè)該基因可能具有物種特異性。這些抗旱相關(guān)基因符合雜交種（F1）BS278*09YH91-5及父母本的表型，推測(cè)這些基因可能參與雜交種的抗旱調(diào)控。下一步將對(duì)這些TaHMT候選基因?qū)π←滊s交種逆境脅迫的應(yīng)答調(diào)控進(jìn)行功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)組蛋白甲基化酶基因家族干旱脅迫響應(yīng)候選基因的生物信息學(xué)分析和實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TaHMT21、TaHMT24、TaHMT42基因可能參與調(diào)控小麥雜交種的抗旱，為二系雜交小麥抗逆分子育種提供了重要的抗旱功能標(biāo)記。

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