小果雪兔子揮發油及多糖組成分析

＊劉瑜 高潭

（西藏農牧學院 食品科學學院 西藏 860000）

引言

揮發油是一類重要的植物次生代謝產物，研究表明，揮發油具有發散解表、芳香開竅、清熱解毒、解暑祛穢、理氣止痛、祛風除濕、祛寒溫里、活血化瘀、殺蟲抗菌等功能[1]，是人們關注的熱點，在食品、醫藥等領域具有較好的應用前景[2]。天然多糖是自然界最豐富的一類生物大分子復合物，也是重要的生物高分子化合物和重要的信息分子。多糖及其復合物分布廣泛，它們參與了細胞各種生命活動的調節，具有多種多樣的生物學功能，如免疫調節和抗腫瘤作用[3-7]，已廣泛用于醫藥和食品行業。

小果雪兔子屬菊科鳳毛菊屬雪兔子亞屬植物，是通稱雪蓮的一種，為我國名貴中草藥，因其良好的藥用價值，一直是人們研究的重點。關于雪蓮藥用化學成分研究較多的有天山雪蓮、雪兔子、新疆雪蓮、綿頭雪蓮、水母雪蓮、星狀雪兔子和叢株雪兔子等，其化學成分含有黃酮類、生物堿、內酯、甾醇、多糖及揮發油等多種成分[8-11]，關于小果雪兔子的相關研究未見報道，本文以小果雪兔子為研究材料，對其揮發油和多糖進行初步分析，以期為小果雪兔子的深入研究奠定基礎。

1.實驗材料與方法

(1)實驗材料

小果雪兔子：采自在西藏日喀則崗巴縣，干燥后粉碎備用。

(2)儀器與試劑

GCMS-QP2010S氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津），FA1004型電子天平（上海恒平）；HH.S21-6電子恒溫水浴鍋（上海博迅）；Avanti JXN-26離心機(德國貝克曼)；Genesys180分光光度計（美國賽默飛）。

葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、肌醇（購自中國藥品生物制品鑒定所）；其他試劑均為國產分析純。

(3)小果雪兔子揮發油的提取

將5.00g小果雪兔子樣品置于500mL圓底燒瓶中，加入100mL蒸餾水，利用水蒸汽蒸餾法提取揮發油，提取時間為3h。餾出液以乙醚萃取后，經無水硫酸鈉干燥，揮去乙醚，得具微香氣味的淡黃色揮發油成分，用1mL二氯甲烷溶解備用。

(4)小果雪兔子揮發油的GC-MS分析

色譜條件：色譜柱：RTX-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；進樣口溫度：280℃；升溫程序：50℃保持4min，以8℃/min升至150℃，保持6min，然后以10℃/min的速度升到300℃，保持15min；載氣（He）流速1mL/min，進樣量0.1μL；分流比：25:1。

質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度250℃；質量掃描范圍m/z40～550。

(5)小果雪兔子多糖的提取

稱取小果雪兔子樣品10.00g，按1:10的比例加入蒸餾水，80℃水提3h，過濾，重復3次，合并濾液，濾液濃縮至原體積的1/10。4000r/min離心5min，去除雜質，上清液加95%工業酒精，使乙醇終濃度達80%，4℃醇析12h，4000r/min離心10min，去除上清液，依次用95%工業酒精、無水乙醇、丙酮洗滌一次，離心，真空干燥，得小果雪兔子粗多糖。

(6)小果雪兔子總糖含量測定

①標準曲線制作

稱取葡萄糖標準品5.20mg，加適量蒸餾水溶解，轉移到50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得濃度為0.104mg/mL葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，加蒸餾水補至1.0mL，分別加入6%的苯酚溶液1mL和濃硫酸2.5mL，以隨行試劑為空白液，在水浴鍋中煮沸15min取出，冷卻15min后，于490nm波長測其吸光值，并以490nm吸光值對葡萄糖含量（μg）制作標準曲線，得線性回歸方程y=0.0053x+0.0043（R2=0.9969）。

②小果雪兔子粗多糖總糖含量測定

稱取小果雪兔子粗多糖4.90mg，用蒸餾水定容至50mL。精密量取1.0mL，按標準曲線制作方法測定490nm波長處吸光值。

(7)單糖組成分析

①單糖標準品的乙酰化修飾

將單糖標準品（葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖及內標肌醇于試管中）；加入1mL 0.1mol/L Na2CO3，30℃干燥箱保溫50min；加KBH 450mg，室溫放置1.5h；25%乙酸中和KBH4，并用陽離子交換樹脂除鹽；用甲醇除酸至中性；將干燥物85℃真空加熱2h；加入0.5mL無水吡啶和0.5mL無水乙酸酐，90℃保溫1h，干燥；加入1mL無水二氯甲烷溶解，離心待測。

②樣品的預處理

小果雪兔子粗多糖（10mg）經2mol/L三氟乙酸120℃封管水解3h，用無水乙醇蒸除三氟乙酸至中性；水解產物的乙酰化修飾方法同單糖標準品。

③氣相色譜-質譜聯用分析（GC/MS）

色譜條件：色譜柱：RTX-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；進樣口溫度：280℃；升溫程序：120℃保持2min，以5℃/min升至195℃，保持4min，然后以4℃/min的速度升到220℃，保持3min；再以30℃/min的速度升到300℃，保持5min；載氣（He）流速1mL/min，進樣量0.1μL；分流比：25:1。

質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度200℃；質量掃描范圍m/z40～550。

2.結果與分析

(1)小果雪兔子揮發油含量

經1.3中提取出小果雪兔子揮發油0.034g，得率為0.68%。

(2)小果雪兔子揮發油化學成分分析

按照色譜-質譜條件對提取的揮發油進行分析，共分離出45種化學成分，各色譜峰相應的質譜圖經人工解析及NIST05s譜庫檢索，鑒定出14種個化合物，用峰面積歸一法計算出各成分的相對質量百分含量（圖1、圖2和表1）。結果顯示，小果雪兔子揮發油主要以酯類、有機酸類、烷烴類、醇類化合物為主，所鑒定化學成分占揮發油色譜峰面積的20.8%。其主要成分為正十一烷酸（3.19%）、正十九烷酸（1.87%）、正二十二烷（1.18%）、正二十三烷（1.91%）、正二十四烷（2.06%）、正十七烷（4.82%）、正二十五烷（2.87%）、正三十四烷（1.96%）、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（1.17%）等。

表1 小果雪兔子成分GC/MS分析結果

圖1 小果雪兔子揮發油GC/MS總離子流圖-1（保留時間20～33min）

圖2 小果雪兔子揮發油GC/MS總離子流圖-2（保留時間35～44min）

從小果雪兔子揮發油中鑒定出的14種化合物中，主要的活性成分有α-杜松醇和六氫假紫羅蘭酮。Chang S T[12]研究表明α-杜松醇具有強烈的殺螨活性。古喬云[13]發現α-杜松醇具有抑菌活性，可以有效抑制金色葡萄球菌、抗藥性金黃色葡萄球菌和糞腸球菌。六氫假紫羅蘭酮在生物體內則用于維生素E和維生素K的合成。本研究的實驗結果表明小果雪兔子揮發油具有一定的殺菌、殺蟲活性，為小果雪兔子揮發油的開發利用提供了理論依據。

(3)小果雪兔子粗多糖含量測定

利用苯酚-硫酸法測定小果雪兔子粗多糖樣品中總糖含量，結果為54.81%。

(4)小果雪兔子粗多糖單糖組成分析

采用氣相色譜-質譜聯用法測定粗多糖樣品中單糖組成，小果雪兔子粗多糖樣品的單糖組成信息由標準單糖總離子流程圖中各峰的保留時間和質譜信息綜合分析得到，結果見圖3和表2，由表可知，小果雪兔子多糖樣品主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖6種單糖組成，其摩爾比例為3.97:7.33:2.91:1:5.45:7.03。

圖3 小果雪兔子粗多糖單糖組成GC/MS總離子流程圖

表2 小果雪兔子粗多糖單糖組成

通過本研究，我們得到了小果雪兔子粗多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，從實驗結果可知，該粗多糖中不含有帶電荷單糖，不便使用離子交換的方式純化該粗多糖，只能利用該粗多糖中各多糖組分分子量的差異不同進行凝膠層析。

3.結論

從小果雪兔子揮發油中鑒定出的14種化合物中，存在具有強烈殺螨作用的α-杜松醇和具有抑菌作用的六氫假紫羅蘭酮，說明小果雪兔子揮發油具有一定的殺菌、殺蟲活性，為小果雪兔子揮發油的開發利用提供了理論依據。小果雪兔子粗多糖中主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖6種單糖組成，其摩爾比例為3.97:7.33:2.91:1:5.45:7.03，研究結果將為小果雪兔子多糖的純化和結構分析奠定基礎。