頂空氣相法測定阿哌沙班原料中12種殘留溶劑

＊陳俊澤 楊安妮 黃秀梅

（浙江永寧藥業股份有限公司 浙江 318020）

阿哌沙班（Apixaban）是一種強效、口服有效的可逆、直接、高選擇性的Xa因子活性位點抑制劑，可以抑制游離及與血栓結合的Xa因子，并抑制凝血酶原活性，對血小板聚集無直接影響，抑制凝血酶的產生，并抑制血栓形成[1-2]。本實驗對阿哌沙班原料中有機溶劑殘留進行了研究。該原料藥的合成和精制過程中，需要用到甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、嗎啉、二甲基亞砜（DMSO）等12種有機溶劑。這些殘留溶劑對人體健康有一定的不利影響，需要除去或者使其殘留的量不超過2020年版《中國藥典》和ICH的限度要求[3-5]。本次實驗采用了氣相毛細管柱頂空氣相色譜法，測定了阿哌沙班工藝中涉及到的12種溶劑，并進行了方法學研究。結果顯示，方法專屬性強，檢測靈敏度高，操作簡單，結果可靠，可用于12種殘留溶劑同時測定。

1.儀器與試劑

（1）儀器。Agilent7890B氣相色譜儀，7697A頂空進樣器，氫火焰離子化檢測器（FID），Agilent工作站，HP-1毛細管柱（Agilent公司）。

（2）試劑。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、嗎啉、二甲基亞砜（DMSO）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）均為阿拉丁公司生產、GC級。阿哌沙班（浙江永寧藥業股份有限公司21060201、21063001、21071401）。

2.實驗方法

(1)色譜條件

色譜柱：HP-1（30m×0.530mm×2.65μm）（100%二甲基聚硅氧烷），升溫程序：起始溫度為40℃，維持6min，以5℃/min的速率升至80℃，維持2min，再以10℃/min的速率升至220℃，維持5min；載氣：氮氣；流速：2.8ml/min；進樣量：1ml；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；分流比：5:1。樣品瓶平衡溫度：100℃；定量環溫度：110℃；傳輸線溫度：120℃；樣品瓶平衡時間：20min；氫氣流量40ml/min；空氣流量400ml/min；尾吹氣25ml/min。

(2)溶液配制

①對照貯備液的配制。分別稱取甲醇約300mg、乙醇約500mg、乙腈約41mg、二氯甲烷約60mg、乙酸乙酯約500mg、四氫呋喃約72mg、三乙胺約500mg、正庚烷約500mg、吡啶約20mg、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）約88mg、嗎啉約100mg、二甲基亞砜（DMSO）約500mg置于200ml量瓶中，用NMP稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

②對照溶液的配制。精密量取對照貯備液5ml置50ml量瓶中，用NMP稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；精密量取對照溶液2ml至20ml頂空瓶中，加蓋密封。

③供試品溶液的配制。取阿哌沙班原料（批號為：21060201、21063001、21071401）約0.1g，精密稱定，分別置于20ml頂空瓶中，加入2ml NMP，加蓋密封。（平行配制2份）

(3)專屬性試驗

取2ml NMP至20ml頂空瓶中，加蓋密封，頂空進樣測定，作為空白。取對照溶液和供試品溶液各2ml分別置于20ml頂空瓶中加蓋密封，同法測定，記錄色譜圖。

(4)定量限與檢測限

①定量限。分別精密量取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、嗎啉和DMSO分別用NMP逐步稀釋至一定濃度，各溶劑的定量限濃度的響應值均滿足S/N≥10記錄色譜圖。

②檢測限。取2.4.1定量限溶液，用NMP稀釋3倍作為檢測限溶液。各溶劑的最低檢測濃度的響應值均滿足S/N≥3，記錄色譜圖。

(5)線性和范圍

取各溶劑的定量限濃度作為線性第一個濃度點；精密量取對照貯備液1mL置于50mL量瓶中，NMP稀釋定容，搖勻，制成質量濃度為20%的線性溶液；精密量取對照品貯備液5ml置于100ml量瓶中，NMP稀釋定容，搖勻，制成質量濃度為50%的線性溶液；精密量取對照貯備液2ml置于25ml量瓶中，NMP稀釋定容，搖勻，制成質量濃度為80%的線性溶液；精密量取對照貯備液5ml置于50ml量瓶中，NMP稀釋定容，搖勻，制成質量濃度為100%的線性溶液；精密量取對照貯備液3ml置于20ml量瓶中，NMP稀釋定容，搖勻，制成質量濃度為150%的線性溶液。分別取各濃度點2ml，置20ml頂空瓶中，加蓋密封，依次進樣測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。

(6)重復性試驗

取對照溶液2ml分別置于20ml頂空瓶中，加蓋密封，平行配制6份，頂空進樣，記錄色譜圖。記錄6份對照溶液中各溶劑的峰面積，計算RSD。

(7)溶液穩定性試驗

取對照溶液2ml置于20ml頂空瓶中，加蓋密封，平行配制8份，分別于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h頂空進樣，記錄色譜圖。記錄不同時間各溶劑峰面積，分別計算RSD。

(8)準確度試驗

取2.5線性和范圍項下濃度為50%的線性溶液，質量濃度為100%的線性溶液，濃度為150%的線性溶液作為準確度試驗溶液。稱取阿哌沙班（批號為：21060201）0.1g，精密稱定，共12份，分別置于20ml頂空瓶中，分別精密加入NMP和各質量濃度溶液2ml，每個質量濃度平行3份，加蓋密封，頂空進樣測定，記錄色譜圖。以加入NMP的供試品作為基底空白，扣除基底空白后，計算各溶劑的回收率及回收率RSD。

(9)樣品測定

取2.2.3的供試品溶液和2.2.2的對照溶液，按照2.1的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算溶劑殘留量。

3.結果與討論

（1）溶劑的選擇。本品在合成及精制過程中使用了DMF和DMSO，但是未使用比上述兩種溶劑沸點更高的NMP，且NMP能夠完全溶解，且對上述12種溶劑均無干擾，故選用NMP作為溶劑。

（2）色譜柱的選擇。考慮到各溶劑之間的極性差異，考察了DB-624、HP-1、DB-WAX三款色譜柱，由于要檢測12種不同的溶劑，且不同色譜之間的極性及填料對溶劑的分離影響較大[6-7]，經過結果比對，最終選定了非極性的HP-1色譜柱。通過升溫程序、平衡時間、平衡溫度、進樣口溫度、流速、分流比等色譜參數的調整，確定了最終的色譜條件，使得12種不同溶劑能夠有效的分離且準確檢測。

（3）專屬性試驗。空白溶劑（NMP）對檢測無干擾。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、嗎啉和DMSO依次出峰，12個溶劑均能有效分離，各峰之間分離度均＞1.5。結果表明，使用該方法檢測各溶劑之間分離效果較好。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性色譜圖

（4）定量限與檢測限。①定量限。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、嗎啉和DMSO的定量限質量濃度分別為3.1μg/ml、4.0μg/ml、2.5μg/ml、4.0μg/ml、1.5μg/ml、0.82μg/ml、0.29μg/ml、0.42μg/ml、3.8μg/ml、2.7μg/ml、6.9μg/ml、6.7μg/ml。表明使用該方法能夠準確檢測12種溶劑含量。②檢測限。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、嗎啉和DMSO的檢測限質量濃度分別為0.93μg/ml、1.2μg/ml、0.75μg/ml、1.2μg/ml、0.45μg/ml、0.25μg/ml、0.087μg/ml、0.13μg/ml、1.2μg/ml、0.81μg/ml、2.1μg/ml、2.0μg/ml。表明該方法的檢測靈敏度高。

（5）線性和范圍。在驗證的濃度范圍內，12種溶劑線性關系良好（R＞0.999），試驗結果見表1。

表1 線性關系試驗結果

（6）重復性試驗。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、嗎啉和DMSO色譜峰面積的RSD分別為0.26%、0.31%、0.54%、0.91%、0.65%、0.60%、0.59%、0.66%、0.88%、1.0%、1.1%和1.1%；結果顯示，該方法重復性好。

（7）溶液穩定性試驗。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶、DMF、嗎啉和DMSO色譜峰面積的RSD分別為1.1%、1.3%、0.85%、0.71%、0.83%、1.8%、0.98%、1.7%、1.8%、1.3%、1.5%和1.9%，結果顯示，對照溶液在室溫放置30h內穩定性較好。

（8）準確度試驗。甲醇的平均回收率為102.4%，RSD為1.8%；乙醇的平均回收率為101.8%，RSD為2.4%；乙腈的平均回收率為102.5%，RSD為3.1%；二氯甲烷的平均回收率為101.2%，RSD為1.6%；乙酸乙酯的平均回收率為101.1%，RSD為1.2%；四氫呋喃的平均回收率為100.1%，RSD為1.5%；三乙胺的平均回收率為98.0%，RSD為1.8%；正庚烷的平均回收率為99.8%，RSD為1.1%；吡啶的平均回收率為99.6%，RSD為1.3%；DMF的平均回收率為100.0%，RSD為1.2%；嗎啉的平均回收率為99.0%，RSD為1.9%；DMSO的平均回收率為101.1%，RSD為1.7%。結果表明，回收率均符合藥典規定，結果見表2。

表2 準確度試驗結果

（9）樣品測定。三批樣品除甲醇的檢出量為0.020%～0.027%，其他溶劑均未檢出。結果表明，該方法能夠準確檢測出樣品中的溶劑殘留量。

4.結論

本文采用了頂空氣相測定法一次性檢測阿哌沙班中12種溶劑殘留。方法驗證結果表明：該方法的檢測簡便，靈敏度高，各溶劑之間分離效果好，在驗證的濃度范圍內，線性關系良好，回收率符合規定，符合《中國藥典》2020年版通則0861殘留溶劑測定法及ICH指導原則Q3C殘留溶劑指導原則的規定。可作為阿哌沙班原料中質量控制方法。