結直腸癌組織鈣離子結合蛋白14、16的表達及與預后的關系研究

苗金魚，何麗彩，劉 媛，張建鋒，王春艷，王敬然，丁秋蕾,邊浩鵬

1.石家莊市人民醫院檢驗科，河北石家莊 050000;2.河北省優撫醫院外一科，河北石家莊 050000;3.河北醫科大學第四醫院普外科，河北石家莊 050000;4.石家莊市人民醫院腫瘤科，河北石家莊 050000;5.石家莊市人民醫院普外科，河北石家莊 050000

結直腸癌(CRC)是當今世界上第四大致命癌癥，每年有近90萬人死于CRC，并且CRC的發病率有逐年升高的趨勢[1]。目前，CRC的治療以手術治療、輔助或新輔助化療及放療為主，但對于晚期轉移性患者，即使積極進行綜合治療，其預后仍較差[2]。深入研究CRC的發生機制，尋找新的CRC標志物，對于CRC的早期診斷、個體化治療的選擇和預后預測具有重要的臨床價值。鈣離子結合蛋白14(S100A14)、鈣離子結合蛋白16(S100A16)均屬于S100鈣離子結合蛋白家族成員，均位于人類一號染色體，具有典型的EF-手型鈣離子結合基序，以同源二聚體或異源二聚體復合物形式發揮功能[3]。S100A14 、S100A16參與多種調控機制和途徑，通過與自分泌的酶、受體、細胞骨架、轉錄因子和核酸相互作用，影響鈣穩態、代謝、增殖、凋亡、遷移、分化、炎癥等生理、病理學過程[4]。近年來研究發現，S100A14、S100A16參與乳腺癌等惡性腫瘤的發生、發展過程，影響腫瘤細胞遷移和侵襲、細胞生長和細胞死亡、腫瘤細胞與腫瘤微環境的相互作用等生理、病理過程[5-6]。有研究報道，腫瘤細胞中S100A14與S100A16之間存在相互協同作用，共同參與腫瘤的惡性進展[7]。由于S100A14通過激活趨化因子配體2，促進腫瘤轉移，CRC中也存在趨化因子配體2激活的現象，推測S100A14在CRC中可通過相似機制發揮作用[5,8]。本研究通過檢測CRC組織中S100A14、S100A16的表達情況，并探討兩者與患者臨床病理參數及預后的關系，以期明確S100A14、S100A16在CRC中表達的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2018年2月石家莊市人民醫院(下稱本院)收治的136例CRC患者為研究對象。其中男82例，女54例；年齡39～78歲，平均(68.52±8.27)歲；腫瘤位置：直腸54例，結腸82例；病理類型：黏液腺癌及其他33例，管狀腺癌103例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期103例，Ⅲ期33例；腫瘤分化程度：高、中分化94例，低分化42例；腫瘤大小：≤4 cm者55例，>4 cm者81例。納入標準：(1)術后病理檢查確診為CRC；(2)初次診治；(3)一般健康狀況良好，卡氏評分>70分；(4)具備手術指征，均完成CRC根治術。排除標準：(1)伴心肺功能衰竭；(2)臨床資料不完整；(3)伴嚴重心腦血管疾病或精神障礙疾病。患者及其家屬均知情同意本研究并已簽署同意書，本研究通過本院醫學倫理委員會審核通過。

1.2免疫組織化學法檢測 將手術切除的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上)用10%中性甲醛固定過夜，石蠟包埋組織后切片機切片，60 ℃烤片2 h；二甲苯脫蠟兩遍；梯度乙醇水化；高壓鍋法檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原熱修復；3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶15 min；封閉液封閉2 h；兔抗人多克隆抗體37 ℃孵育2 h，S100A14、S100A16一抗稀釋比1∶500，抗體購自英國Abcam公司，貨號：ab251779、ab130419；山羊抗兔二抗孵育1 h；辣根過氧化物酶標記三抗孵育1 h；DAB顯色；蘇木素復染5 min；梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后，倒置顯微鏡400倍下觀察(型號：CKX53，廠家：日本奧林巴斯株式會社)。免疫組化染色結果用染色面積評分乘以染色強度評分表示，由兩位病理科醫師共同閱片診斷并打分。染色面積：無染色為0分，染色面積<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，褐色為3分。二者乘積小于3分為陰性，大于等于3分判定為陽性[9]。

1.3隨訪 所有患者自出院開始進行隨訪，以電話或者門診復查方式進行隨訪，隨訪截至2021年2月。隨訪終點為患者死亡或隨訪結束。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統計分析。計數資料采用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以Spearman秩相關分析S100A14與S100A16表達的相關性。采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析不同S100A14、S100A16表達情況CRC患者的生存情況。COX比例風險回歸分析影響CRC患者預后的危險因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CRC組織及癌旁組織中S100A14、S100A16表達 CRC組織中S100A14、S100A16陽性表達率明顯低于癌旁組織中S100A14、S100A16的陽性表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 CRC組織及癌旁組織中S100A14、S100A16表達[n(%)]

2.2CRC組織中S100A14、S100A16表達的相關性 利用Spearman秩相關分析CRC中S100A14、S100A16表達的相關性，結果顯示S100A14與S100A16表達呈正相關(r=0.595,P<0.001)。

2.3CRC組織中S100A14、S100A16表達與臨床病理參數的關系 CRC組織中S100A14、S100A16表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關(P<0.05)，與年齡、性別、病理類型和腫瘤位置、腫瘤大小無關(P>0.05)。見表2。

表2 CRC組織中S100A14、S100A16表達與臨床病理參數的關系[n(%)]

2.4CRC組織中不同S100A14、S100A16表達患者生存預后比較 136例CRC患者中，失訪2例，死亡40例，存活94例，3年生存率為70.15%(94/134)。S100A14陽性表達患者41例，死亡5例，3年生存率為87.80%(36/41)；S100A14陰性表達患者93例，死亡35例，3年生存率為62.37%(58/93)。S100A14陰性表達患者3年生存率明顯低于陽性表達患者，差異有統計學意義(χ2=6.532，P=0.011)。S100A16陽性表達患者37例，死亡4例，3年生存率為89.19%(33/37)；S100A16陰性表達患者97例，死亡36例，3年生存率為62.89%(61/97)。S100A16陰性表達患者3年生存率明顯低于陽性表達患者，差異有統計學意義(χ2=7.270，P=0.007)。見圖1。

圖1 不同S100A14、S100A16表達情況CRC患者的生存曲線

2.5COX比例風險回歸分析影響CRC患者預后的危險因素 以CRC患者為樣本，建立COX比例風險回歸模型。以CRC患者的生存預后為因變量(賦值：1=死亡，0=生存，t=生存時間)，自變量包括CRC患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、腫瘤位置、腫瘤分化程度、TNM分期、S100A14、S100A16，分析結果表明TNM分期Ⅲ期、S100A14陰性、S100A16陰性是影響CRC患者預后的危險因素(P<0.05，HR>1)。見表3。

表3 影響CRC患者預后的Cox比例風險回歸分析

3 討 論

CRC約占全世界每年診斷的癌癥和癌癥相關死亡人數的10%，它是女性中第二常見的癌癥，男性中第三常見的癌癥[1]。多種因素均能夠增加CRC的發病風險，包括人口老齡化、炎性腸病及家族遺傳病史等，吸煙、飲酒等不良生活方式也影響CRC的發生[10]。深入探索CRC的疾病機制，尋找CRC預后判斷的腫瘤標志物具有重要意義。目前認為，CRC的發生與染色體不穩定性、微衛星不穩定性和CpG島甲基化有關，涉及促癌基因如原癌基因KRAS、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)等的過度激活和抑癌基因APC、TP53等的失活。例如APC突變導致β-連環蛋白易位到細胞核并驅動與腫瘤發生和侵襲有關的基因的轉錄[11]，而 KRAS 和PI3K的突變導致MAP激酶的持續激活，從而促使細胞增殖[12]。因此，尋找影響CRC發生發展過程中關鍵驅動基因的表達變化，有利于CRC的預后判斷。

S100家族蛋白由 21 種不同的亞型組成，包括S100A、S100B、S100P及S100Z。17 種 S100A亞家族蛋白(包括 S100A14、S100A16等)位于染色體 1q21 上的2Mb區域內[4]。大多數S100家族蛋白能夠通過影響晚期糖基化終產物受體、表皮生長因子受體通路和p53通路，在多種惡性腫瘤中發揮促進腫瘤增殖和轉移的作用[13-14]。S100A14蛋白編碼基因包含2 165個堿基，編碼104個氨基酸，主要表達在結直腸黏膜、胃、卵巢及輸卵管等組織[7]。有研究發現，S100A14在乳腺癌、宮頸癌等腫瘤中異常表達，并能夠促進腫瘤的增殖[5,15]。本研究中，CRC組織中S100A14的表達顯著下調。目前CRC中調控S100A14表達的機制尚不清楚。ZHANG等[16]學者發現，腫瘤中S100A14的表達受到非編碼RNA如微小RNA-153-5p的調控，微小RNA-153-5p的表達能夠降低S100A14 mRNA的穩定性，抑制其表達。HE等[17]研究發現，在CRC中miR-153-5p能夠通過抑制抑癌基因Bcl-2的表達，促進腫瘤細胞耐藥性的形成，導致腫瘤進展。推測CRC中S100A4可能是新的miR-153-5p下游靶點，值得深入研究。本研究結果顯示，S100A14的表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關，表明CRC中S100A14的表達下調促進腫瘤的進展。SAPKOTA等[18]學者報道，S100A14能誘導腫瘤細胞G1期阻滯，S100A14表達降低后，其G1期阻滯能力降低，促進口腔鱗癌細胞的增殖，并且腫瘤抑制蛋白p53的功能發揮也依賴于S100A14，敲低腫瘤細胞中S100A14的表達，p53的抑癌能力也顯著下調。進一步研究S100A14對CRC患者預后的影響，結果顯示S100A14陰性表達的CRC患者預后較差，且S100A14陰性表達是CRC患者不良預后的危險因素，表明S100A14可用于CRC的預后判斷。

S100A16是S100鈣結合蛋白家族成員，參與多種信號通路的調節，如細胞外信號調節激酶、Notch和核因子κB通路等，并參與染色體重排，與宮頸癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的發生和進展密切相關[19-20]。本研究中，CRC組織中S100A16表達降低，可能與CRC中S100A16的表觀遺傳學修飾有關。研究表明，S100A16基因啟動子區域的CpG島的高甲基化狀態，誘導S100A16基因的表達沉默，負性調控S100A16表達[21]。本研究中，CRC組織中S100A16的表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關。提示S100A16的表達降低促進CRC的發生、發展。有文獻報道[22]，S100A16一方面通過抑制JNK/p38 MAPK 信號通路的激活進而抑制腫瘤細胞的增殖，另一方面，S100A16通過抑制腫瘤細胞的上皮間質轉化，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲等惡性生物學行為[7]。此外，ZHANG等[23]發現，S100A16通過PI3K/AKT通路抑制白血病細胞的細胞增殖，S100A16的低表達與成人B細胞急性淋巴細胞白血病較高的復發率和較短的無復發存活時間相關。本研究中，S100A16陰性表達的CRC患者預后較差，亦表明檢測CRC組織中S100A16的表達有助于患者的預后判斷。

本研究中，CRC中S100A14與S100A16的表達呈正相關，表明其在CRC的發生、發展中可能存在相互協同的生物學功能。TANAKA等[24]學者在乳腺癌中發現，S100A14與S100A16在細胞內空間分布上，均以鈣非依賴性方式結合定位于細胞質和細胞膜中的肌動蛋白上，兩者之間的相互協同作用促進細胞骨架動力學的變化，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。但目前CRC中兩者的具體作用機制有待深入探索。

綜上所述，CRC組織中S100A14、S100A16表達降低，兩者表達呈正相關。S100A14、S100A16表達與TNM分期、腫瘤分化程度有關，兩者共同促進CRC的惡性發展。此外，TNM分期Ⅲ期、S100A14陰性、S100A16陰性是影響CRC患者預后的危險因素。S100A14、S100A16可用于評估CRC患者生存預后，值得臨床深入探索。