血清TL1A升高對ANCA相關血管炎活動度的臨床價值

陳雪禮，薛國輝，華 琳，劉曉峰，李觀華，張啟貴，晏慧民

九江市第一人醫院：1．檢驗科；2．腎內科，江西九江 332000

抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)是寡免疫復合物沉積介導的免疫性壞死性血管炎[1-2]，患者存在不可逆器官損傷的風險[3]。AAV的疾病活動度不僅影響治療方案的選擇，還提示了疾病的復發率或難治性，因而準確地定義AAV的活動度非常重要。目前，伯明翰血管炎活動性評分(BVAS)、醫師全局評估、疾病程度指數和五因素評分(FFS)等可用于評估 AAV 疾病活動性[4-6]。但這些指標的主觀性和復雜性使其難以應用于臨床實踐，因而發掘新的客觀評價標志物至關重要[7]。此外，AAV的確切發病機制尚不清楚。已有證據表明靶向與 CD4+T 輔助細胞亞群分化相關的細胞因子可有效改善抗髓過氧化物酶抗體(MPO)腎小球腎炎[8]。其中T淋巴細胞17(Th17)細胞可誘導白細胞介素-8(IL-8)和CXCL-1的分泌，而這些細胞因子可促進ANCA靶抗原的表達。而在抗MPO腎小球腎炎動物模型中，IL-17缺陷發揮保護作用[9]。這些研究均表明Th17參與了AAV的致病機制，但其調控機制不明。有研究發現腫瘤壞死因子配體相關分子1A (TL1A)可調控Th17分化[10]，據此本文推測TL1A可能在AAV中發揮作用，但報道甚少。本研究將通過分析AAV患者TL1A的表達變化及其與Th17細胞相關細胞因子和臨床參數間的關系，為AAV的發病機制研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2022年2月于本院就診并確診為AAV的患者51例為AAV組，所有患者均符合美國風濕病學會關于AAV的分類標準及2012年Chapel Hill 共識會議關于AAV的定義[11-12]。另選取同期于本院體檢中心行健康檢查的50例體檢健康者作為對照組。兩組人群年齡和性別構成比比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入的AAV病例中MPO-AAV 42例，蛋白酶-3(PR-3)-AAV 9例。所有患者均被告知本研究的目的、并簽署知情同意書，研究經過醫院倫理委員會批準。AAV病例納入標準：(1)AAV初診患者；(2)納入研究前6個月內無激素使用史；(3)無感染、重大心血管疾病、過敏性疾病、腫瘤及其他自身免疫性疾病。排除標準：(1)非初診患者；(2)就診前6個月內使用過免疫抑制劑或非甾體抗炎藥等藥物；(3)既往和當前合并急慢性感染、免疫性疾病及腫瘤等疾病。記錄AAV患者的活動度評分即2003版伯明翰血管炎評分(BVAS-2003)。本研究經本院醫學倫理委員會討論通過。

1.2標本采集及處理 抽取所有受試者清晨空腹靜脈血4 mL，其中2 mL分裝于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)，用于流式細胞術檢測。另2 mL靜脈血分裝于干燥管中，4 000 r/min，離心10 min分離血清并于-80 ℃冰箱保存，用于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

1.3流式細胞術檢測Th17細胞 用RPMI 1640調整PBMC濃度至2.0×106/mL，接種于6孔板中，加入25 ng/mL佛波酯、500 ng/mL離子霉素及1.7 μg/mL莫能霉素，37 ℃ 5% CO2培養箱中孵育4 h。然后取出細胞加入抗CD3和CD4抗體各10 μL，充分混勻后室溫避光孵育20 min，用PBS 清洗2次后，1 200 r/min離心去上清液，加入固定劑固定15 min，PBS清洗1次后離心去上清液，加入破膜劑室溫孵育5 min離心去上清液。加入抗IL-17抗體10 μL，室溫避光孵育20 min，離心去上清后加入500 μL PBS重懸后上機檢測。圈定CD3+CD4+細胞群，進一步分析 Th17細胞群，其表型定義為CD3+CD4+IL-17+。

1.4ELISA測定血清TL1A、IL-17和IL-23的水平 血清TL1A、IL-17和IL-23測定均采用ELISA法，所需試劑盒均購自美國R&D公司，分別為Human TL1A/TNFSF15 DuoSet ELISA(DY1319-05)、Human IL-17 Quantikine ELISA Kit(D1700)和Human IL-23 Quantikine ELISA Kit(M2300)，所有步驟均嚴格參照試劑盒操作說明書執行。

2 結 果

2.1納入患者的基線特征 納入研究的AAV患者基線資料見表1。平均年齡為(53.17±16.89)歲，其中男16例(31.37%)。15例為肉芽腫性多血管炎、26例為顯微鏡下多血管炎和10例嗜酸性肉芽腫性多血管炎。在臨床表現中，腎臟表現是最常見的(82.35%)，其次是肺部(68.63%)和系統性(41.18%)表現。AAV患者BVAS-2003疾病活動度評分為(16.32±7.81)分。

表1 納入的AAV患者臨床基線特征

2.2AAV組與對照組實驗室一般資料比較 與對照組相比，AAV組的白細胞計數(WBC)、中性粒細胞計數(NEU)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)和C反應蛋白(CRP)均明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)。此外，AAV組相較對照組具有更低水平的血紅蛋白濃度(Hb)、淋巴細胞計數(LYM)、血清清蛋白(ALB)和腎小球濾過率(GFR)，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 AAV組與對照組實驗室一般資料比較

2.3AAV患者血清TL1A、Th17、IL-17及IL-23的變化 ELISA結果顯示，與對照組相比，AAV組具有更高水平血清IL-17(5.67±2.16vs.2.72±1.34)、IL-23(12.12±4.91vs.7.14±2.93)和TL1A(22.52±7.72vs.10.16±4.45)，差異均有統計學意義(均P<0.05)。而流式細胞術結果顯示Th17細胞頻率在AAV患者中同樣顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 AAV患者血清的變化注：A為IL-17；B為IL-23；C為TL1A；D、E為Th17。

2.4TL1A與實驗室指標及活動度評分BVAS-2003的相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示AAV患者中血清TL1A與血清IL-17、Th17頻率、CRP及BVAS-2003均呈顯著正相關(均P<0.05)。而與GFR呈顯著負相關性(P<0.05)。與其他指標間的相關性并不顯著(均P>0.05),見圖2。

圖2 TL1A與IL-17、Th17、CRP、BVAS-2003及GFR間的相關性

2.5以BVAS-2003為標準繪制血清TL1A的ROC曲線 BVAS 評分總分15 分以上為活動期，反之則為緩解期，本研究中活動期患者22例，緩解期患者30例。據此繪制TL1A預測疾病活動期的ROC曲線，血清TL1A預測AAV疾病活動期具有較好的價值，其曲線下面積(AUC)高達0.87(95%CI：0.775 9～0.966 3，P<0.001)，最佳cut off值為19.95 ng/mL，靈敏度為90.48%，特異度為72.41%。并與IL-17、IL-23、Th17及CRP進行比較，TL1A預測AAV疾病活動期的AUC最大，見圖3。

圖3 血清TL1A、IL-17、IL-23、Th17及CRP預測AAV活動性的ROC曲線

3 討 論

在臨床實踐中，急性期反應物如CRP和 ANCA 滴度是評估當前 AAV 活動度的最常見的生物標志物[15]。然而，由于這些實驗室變量的低特異性，需要新的和便捷的替代生物標志物來更加準確地評估AAV 的疾病活動性。目前，研究證實T細胞介導的免疫反應在AAV發病機制中扮演重要角色，有報道發現AAV 患者腎臟活檢組織中可見大量T 細胞浸潤，肉芽腫組織亦可見大量淋巴細胞浸潤[16]。其T 細胞處于持續的活化狀態，激活的T 細胞可通過細胞毒效應、聚集和激活巨噬細胞等多種途徑而引起組織損傷[8]。AAV 患者的Th17細胞及相關效應細胞因子異常上調，這可能是引起AAV炎癥產生的重要原因。以往研究顯示在AAV患者中產生IL-17的淋巴細胞數量增加，活動期血清IL-17水平更高[17]。此外，在AAV患者的腎小球和腎間質中觀察到IL-17陽性細胞存在，并證實AAV患者的腎組織中IL-17 mRNA表達增加[18]。近期越來越多的證據表明Th17活化在 AAV 的發病機制中起關鍵作用。作為Th17細胞分化的關鍵調節因子，TL1A在多種自身免疫性疾病，如類風濕關節炎、強直性脊柱炎、炎癥性腸病、原發性膽汁性肝硬化和銀屑病中均已被證實顯著升高并與疾病活動相關[19]，但其在AAV患者中如何變化，并不清楚。

在本研究中，血清TL1A水平在AAV患者中顯著升高，與 BVAS-2003顯著相關。此外，血清TL1A與Th17細胞及其相關效應細胞因子亦存在顯著正相關性，提示其可能在AAV中扮演調控Th17細胞的角色。SUN等[20]發現在與骨關節炎患者和健康對照者相比，類風濕關節炎患者血清和關節液中TL1A水平顯著升高，且血清水平與類風濕關節炎特異性自身抗體相關，包括類風濕因子和抗瓜氨酸蛋白抗體。且TL1A刺激后來自類風濕關節炎患者的外周血單核細胞所產生的抗體顯著升高。但該研究并未發現血清TL1A 水平與類風濕關節炎疾病活動之間的相關性。值得注意的是，本研究中的ROC曲線結果顯示血清TL1A水平預測AAV患者疾病活動度具備較好的性能，可能是評估 AAV 疾病活動的潛在生物標志物。血清TL1A水平與AAV 疾病活動之間的顯著關聯在理論上可能是因為TL1A可以由活化的T淋巴細胞和巨噬細胞分泌[21]，而這些細胞在AAV的發病機制中起重要作用。T淋巴細胞活化標志物在AAV患者血清中升高。此外，ANCA的IgG亞型主要由IgG1和IgG4組成，提示需要T 細胞參與ANCA的同種型轉換[22]。多項研究發現，持續T細胞浸潤及活化與AAV相關，并最終導致終末期腎臟病，而巨噬細胞可能會在血管炎靶組織中積聚，并在急性炎癥消退后的損傷反應階段引起 AAV 中的器官損傷[23-24]。這些結果支持血清TL1A可能是評估AAV活性的生物標志物的證據。其次，由于血管損傷，內皮細胞可以分泌血清TL1A。有研究表明AAV中血管損傷和血管生成的循環分子水平顯著增加[24]。因此，推測當發生廣泛的血管損傷和血管生成時，血清TL1A水平會上調?；蛘?，TL1A也可能通過增加趨化性、細胞黏附和血管內皮細胞遷移與AAV炎癥直接相關，從而導致血管損傷增加。有研究表明，TL1A在同為廣泛血管損傷的川崎病患者中顯著上調[25]，這也間接支持這一假說。

總之，本研究初步發現血清TL1A在AAV患者中異常上調，且與同樣升高的Th17細胞密切相關。此外，與BVAS-2003的顯著相關性及ROC曲線結果表明血清TL1A可能成為AAV患者疾病活動度評價的新的生物標志物。當然，這有必要在未來的研究中擴大樣本量進一步驗證，且需利用TL1A敲除的動物模型探究TL1A參與AAV發病過程的分子機制。