時差成像干式培養與傳統濕式培養應用于不同年齡胚胎發育的效果

張豆豆，王 靜，劉 淼，盧大儒，劉素英*

1.復旦大學附屬中山醫院生殖醫學中心，上海 200032

2.復旦大學生命科學學院，上海 200000

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）是治療不孕癥的有效手段，而胚胎體外培養是IVF-ET 的關鍵環節。胚胎培養箱模擬體內環境，保持pH 值、溫度、氣體含量、滲透壓和濕度與體內一致。盡管培養箱中覆蓋油的培養皿消除了pH 值和溫度的變化，但難以克服培養基滲透壓變化的影響。Yumoto 等［1］發現，干式培養箱內培養基滲透壓不穩定；Boumerdassi等研究［2］發現，無論培養皿中礦物油含量如何，干式培養箱中微滴的滲透壓在培養3 d 后都明顯升高。此外，Fawzy 等［3］的前瞻性隨機對照研究表明，干式培養與濕式培養相比顯著降低了著床率及臨床妊娠率。

時差成像（time-lapse，TL）技術是近年來發展的一種新型胚胎培養與胚胎實時觀察技術，其有效性和安全性備受關注［4-6］。與傳統培養時需頻繁拿取胚胎至箱外觀察不同，TL 能為胚胎提供更穩定的培養環境，不用開箱即可動態觀察受精及胚胎發育情況［5］。然而，應用干式TL 培養箱培養時，隨著培養時間的延長，滲透壓也隨之發生變化［7］。TL 培養滲透壓變化對胚胎發育的影響須進一步確定。因此，本研究以傳統濕式培養為對照，結合培養5 d 后微滴滲透壓變化，分析TL 培養箱中不同年齡女性胚胎發育的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性選擇 2020 年 7 月至 2021年 12 月在本院第 1 次行 IVF-ET 治療的 2 390 對夫妻，胚胎培養共2 390 個周期，其中TL 組640 對夫妻 640 個周期，對照組 1 750 對夫妻 1 750 個周期。兩組女方年齡、不孕類型、不孕因素、女方體質量指數（BMI）、基礎卵泡刺激素（FSH）水平、基礎黃體生成素（LH）水平、促性腺激素（Gn）用量、受精方式和平均獲卵數等差異均無統計學意義（表1）。

表1 兩組患者臨床特征比較

1.2 胚胎培養方法及滲透壓的測量 兩組分別應用ASTEC APM-50D 濕式三氣培養箱和ESCO Miri-TL 干式培養箱，采用一步法胚胎培養液（vitrolife GTL）培養。采卵前1 d 配液充分覆油并過夜平衡。滲透壓檢測：取過夜平衡后的培養液50 μL，等分后放入滲透壓計樣品管中，立即用德國GONOTEC 冰點滲透壓儀 OSMOMAT 030 進行滲透壓測試，每份樣品重復測試3 次以確保測值準確性。對于每組測試樣品，每次從培養箱中取出1 個培養皿來測量滲透壓，其他留在培養箱中。同一天要測量的培養皿放于培養箱同一腔室。測試前每天校準滲透壓計，測試時間點保持一致。

1.3 胚胎獲取 所有研究對象均采用拮抗劑方案，于月經后第2 天或第3 天，給予重組人促卵泡激素（rhFSH，G-F，默克）75～300 U/d 促排卵，根據患者年齡、竇卵泡數（AFC）、抗繆勒管激素（AMH）、BMI 確定啟動劑量。當主導卵泡直徑達 14 mm 或 LH＞10 U/L 時加用促性腺激素釋放激素拮抗劑GnRH-ant 至注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）日。扳機后36～38 h 取卵。根據患者情況，于獲卵后2～4 h 行常規體外受精（IVF）或卵胞漿內單精子注射受精（ICSI）；授精后16～18 h 檢查受精情況，并繼續培養至第5 天或第6 天，根據臨床情況行新鮮胚胎移植或胚胎冷凍保存。

1.4 胚胎質量評估 常規濕式培養第2 天或第3天評估卵裂期胚胎情況，第5 天或第6 天評估胚胎囊胚發育情況。受精后第3 天參考Brainden 標準對卵裂期胚胎質量進行評分，正常受精7～9 個細胞、評分1～2 級的胚胎為優質胚胎；≥6 個細胞、評分3 級及以上的胚胎為有效胚胎［8］。受精后第5～6 天參考Gardner 等［9］的方法對囊胚質量進行評分，優于3BB 定義為優質囊胚。TL 培養除卵裂期和囊胚期常規觀察外，每5 min 記錄1 次胚胎圖像，生成動態胚胎發育視頻［5］。

比較兩組正常受精率、正常卵裂率、有效胚胎率、優質胚胎率、囊胚形成率和優質囊胚率等。正常受精率＝正常受精數/獲卵數×100%；正常卵裂率＝正常卵裂數/總受精數×100%；有效胚胎率＝有效胚胎數/正常卵裂數×100%；優質胚胎率＝優質胚胎數/正常卵裂數×100%；囊胚形成率＝囊胚形成數/培養囊胚數×100%；優質囊胚率＝優質囊胚數/培養囊胚數×100%。

1.5 統計學處理 采用 SPSS 19.0 進行統計學分析，計量資料以x±s 表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料以n(%)表示，組間比較采用檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 滲透壓測量結果 結果（圖1）顯示：兩組微滴滲透壓在培養期間均增加。培養第3 天，TL組微滴的滲透壓增加約14.6 mOsm/kg（5.4%），對照組增加約5.0 mOsm/kg（1.8%，P＝0.222）；培養第5 天，TL 組滲透壓3 次測量平均值約為 300 mOsm/kg，達最高值，增加 28.6 mOsm/kg（10.6%），對照組增加約12.0 mOsm/kg（4.4%，P＝0.052）。

圖1 兩組滲透壓變化

2.2 兩組女方不同年齡胚胎發育情況比較 結果（表2）顯示：20～29 歲：TL 組有效胚胎率、優質胚胎率均顯著高于對照組（P＜0.01）；30～34歲：TL 組優質胚胎率、囊胚形成率、優質囊胚率均高于對照組（P＜0.05）；35～39 歲：TL 組各指標與對照組差異無統計學意義；≥40 歲：TL 組優質胚胎率、囊胚形成率、優質囊胚率均低于對照組（P＜0.05）。

表2 女方不同年齡組兩種培養箱胚胎發育比較

3 討 論

一步法培養基結合臺式TL 培養近年來已在輔助生殖領域得到較多應用，其優點為不需要開箱即可動態觀察胚胎發育，為胚胎選擇提供更多依據。但是，其培養效果目前存在爭議。2012 年，Kirkegaard 等［10］將 TL 培養和常規濕式培養效果進行比較，以第2 天4 個細胞、第3 天7～8 個細胞、第5 天囊胚形成率和種植率為評估指標，結果顯示兩組間差異無統計學意義。Sciorio 等［11］發現TL 培養第2天和第3天的優質胚胎率高于常規培養方法，而第5 天或第6 天的優質囊胚率與常規培養方法差異無統計學意義。2018 年 Barberet 等［12］的隨機對照研究顯示，TL培養第3 天優質胚胎率高于常規培養。

目前這2 種培養方式在不同女方年齡組的應用效果鮮見報道。本研究發現，在女方低齡（20～34 歲）組，TL 組胚胎發育情況優于常規培養；在高齡組（≥40 歲），TL 組優質胚胎率、囊胚形成率和優質囊胚率則顯著降低；年齡34～39歲，兩組間胚胎發育情況差異無統計學意義。隨著培養時間的延長，TL 組微滴滲透壓明顯增加，第5 天滲透壓接近培養基最高閾值，提示TL 培養箱中微滴水分隨培養時間延長逐漸蒸發，因此滲透壓逐漸增加，雖然與對照組差異無統計學意義，但仍有參考價值。文獻［13］表明，滲透壓增加至300 mOsm/kg 時，小鼠胚胎發育潛能急劇下降。雖然該滲透壓閾值在人類尚未明確，但人與鼠生殖道生理特性相似，提示人類與小鼠體外滲透壓要求可能相當［14］。本研究中，滲透壓改變并沒有影響年輕女性胚胎的發育，可能與年輕女性卵子質量佳，能對抗滲透壓改變有關，但對于高齡（≥40 歲）患者，胚胎發育潛能本身較差，對環境特別是滲透壓的改變更為敏感，滲透壓的增加顯著抑制了胚胎的發育潛能,降低了囊胚形成率及優質囊胚率。

綜上所述，本研究顯示，干式TL 結合一步法培養基較傳統濕式培養在年輕女性體外胚胎培養中更有優勢，但是隨著培養時間的延長，滲透壓逐漸升高，對高齡女性胚胎發育呈現不利影響，提示高齡女性胚胎培養可能更適用傳統濕式方法。如何充分利用TL 培養優點，又能克服長時間培養后滲透壓的改變可能須獲得輔助生殖領域更多的關注，開發可加水的濕式TL 培養箱可能有幫助。此外，本研究為單中心回顧性研究，未來需要多中心更大樣本RCT 研究驗證TL 培養對胚胎發育潛能的影響。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。