羅布麻的抗衰老作用機(jī)制研究

王 飛，李祥婷，徐莉莉，張雅珍，向 軍,3*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200032

3.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院內(nèi)科研究所，上海 200032

羅布麻屬夾竹桃科植物［1］，是藥食同源植物，具有廣泛的藥用和保健功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)羅布麻葉浸膏片可改善夜尿等部分衰老癥狀，對降低血清過氧化脂質(zhì)、升高發(fā)鋅、提高男性血漿睪丸酮可能具有一定作用［2］；可提高老年人自然殺傷細(xì)胞活性及紅細(xì)胞超氧化物歧化酶含量，改善甲皺微循環(huán)的血流狀態(tài)，有一定延緩衰老的作用［3］。在動(dòng)物模型中，羅布麻提取物可延長果蠅壽命，促進(jìn)家兔及大鼠的免疫功能，降低大鼠血清過氧化脂質(zhì)水平［4］。鑒于羅布麻抗衰老的多成分、多靶點(diǎn)的藥理學(xué)特征，本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)一步探討羅布麻的抗衰老作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 羅布麻成分收集和篩選 采用數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）與文獻(xiàn)檢索相結(jié)合的方法收集羅布麻的主要活性成分。根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)對其進(jìn)行篩選，該參數(shù)為藥物口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%以及類藥性（drug likeness, DL）≥0.18。

1.1.2 羅布麻成分靶點(diǎn)預(yù)測 采用中藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫TCMSP、TCMID 結(jié)合文獻(xiàn)檢索的方法收集和篩選羅布麻的成分靶點(diǎn)。

1.3 衰老的疾病靶點(diǎn)預(yù)測 在疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards（http://www.genecards.org/），以關(guān)鍵詞“aging”獲得衰老的相關(guān)基因。

1.4 靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 利用Venny 2.1 獲得羅布麻成分與疾病靶點(diǎn)的交集，隨后導(dǎo)入STRING（http://stringdb.org/），進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果 以 TSV 格 式 導(dǎo) 入 Cytoscape 3.8.1（http://www.cytoscape.org/）軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.1（http://www.cytoscape.org/）將上述所得結(jié)果網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.6 靶點(diǎn)功能和通路富集分析 利用基因本體（gene ontology, GO） 數(shù) 據(jù) 庫 和 京 都 基 因 與 基因 組 百 科 全 書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG） 數(shù) 據(jù) 庫， 以 及R3.6.3 軟 件 運(yùn)行的Bioconductor 生物信息軟件包（http://www.bioconductor.org/）對靶點(diǎn)功能和通路進(jìn)行富集分析。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57-BL/6 小鼠，雄性，8 周齡，體質(zhì)量18～20 g，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物使用通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005；動(dòng)物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0006］。

1.2.2 藥物和試劑 羅布麻提取物（日本常盤生藥研究所）、D-半乳糖（美國Sigma 公司）、蘇木精-伊紅(H-E)染液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）、兔抗鼠p53 一抗 (江蘇Immunoway公司）、兔抗鼠GAPDH （江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）、FITC 標(biāo)記羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch 公司）、羊抗兔IgG-HRP（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）、電熱扶風(fēng)干燥箱（上海圣欣科學(xué)儀器有限公司）、BX43 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2.4 動(dòng)物分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、羅布麻組，每組6 只。參考既往研究［5］，模型組和羅布麻組頸背部皮下注射5% D-半乳糖（100 mg·kg－1·d－1），對照組同部位注射等體積生理鹽水。參考既往研究［6］羅布麻給藥劑量，羅布麻組在注射D-半乳糖的同時(shí)，給予 100 mg·kg－1·d－1的羅布麻提取物灌胃，模型組每天等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)造模和給藥8 周。

1.2.5 組織取材 造模8 周后頸椎脫臼處死小鼠，暴露胸腹部，常規(guī)消毒，打開腹腔，取小鼠肝臟組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)入－80 ℃保存，用于后續(xù)H-E 染色、免疫熒光染色和Western 印跡檢測。

1.2.6 H-E 染色 取肝臟組織，4%多聚甲醛固定，脫水、包埋，制備4 μm 石蠟切片，隨機(jī)選取肝臟切片（n=3），經(jīng)梯度二甲苯脫蠟、梯隊(duì)乙醇復(fù)水，行H-E 染色，脫水、透明、封片。光鏡下觀察肝臟組織大體病理改變。

1.2.7 免疫熒光染色 取肝臟組織，制備4 μm 冰凍切片，隨機(jī)選取肝臟切片（n=3），1%丙酮固定，經(jīng)3% H2O2-甲醇溶液滅活、1% BSA 封閉后，p53一抗（1 ∶ 100）37℃孵育 2 h，F(xiàn)ITC 標(biāo)記熒光二抗（1 ∶ 200）37℃孵育 2 h，DAPI 復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察p53 的表達(dá)情況。

1.2.8 Western 印跡法 取肝臟組織，提取總蛋白，樣品經(jīng)過蛋白質(zhì)含量測定后，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，BSA 封閉，采用1 ∶ 1 000 稀釋的一抗 4℃孵育過夜，1 ∶ 1 000 稀釋的二抗37℃孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法反應(yīng)，曝光，顯影，拍照，光密度定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.1.1 羅布麻活性成分篩選及其靶點(diǎn) 經(jīng)數(shù)據(jù)庫查找出56 個(gè)活性成分，篩選并去重后獲得谷甾醇（sitosterol）、花青素B1（procyanidin B1）、山奈酚（kaempferol）、(+)-兒茶素［(+)-catechin］、木犀草素（luteolin）、表兒茶素（ent-Epicatechin）6 個(gè)活性成分，及羅布麻寧（apocynin）、金絲桃苷（hyperoside）、蕓香苷（rutin）3 個(gè)活性成分，共計(jì)9 個(gè)活性成分（表1）。利用數(shù)據(jù)庫查詢上述活性成分的靶點(diǎn)信息，篩選并去重后得到122 個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 羅布麻主要活性成分信息

2.1.2 羅布麻抗衰老的潛在靶點(diǎn) 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出共計(jì)2 183 個(gè)與衰老相關(guān)靶點(diǎn)，采用Venny 2.1 軟件與羅布麻活性成分靶點(diǎn)交集，得到85 個(gè)共同靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 羅布麻活性成分靶點(diǎn)與衰老靶點(diǎn)交集Venny 圖

2.1.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用Cytoscape 3.8.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)（圖2），共132個(gè)節(jié)點(diǎn)和276 條邊。山奈酚、木犀草素以及蕓香苷與靶點(diǎn)的聯(lián)系最為廣泛。

圖2 羅布麻成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.1.4 潛在靶點(diǎn)的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖3A），篩選出degree 值排名前30位的靶點(diǎn)，其中p53、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等可能是抗衰老的主要潛在靶點(diǎn)（圖3B）。

圖3 潛在靶點(diǎn)的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.1.5 GO 分子功能富集分析 結(jié)果（圖4）顯示：通過GO 富集分析，篩選出85 個(gè)靶點(diǎn)116 個(gè)分子功能條目（P＜0.05），主要為磷酸酶結(jié)合、泛素樣-蛋白連接酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、氧化還原酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合以及細(xì)胞因子活性等。

2.1.6 KEGG 通路富集分析 結(jié)果（圖5）顯示：通過KEGG 通路富集分析篩選出85 個(gè)靶點(diǎn)163 條信號通路，主要與磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphoinositide3-kinase-Akt, PI3KAkt）信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE（advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product）信號通路、內(nèi)分泌抵抗、IL-17 信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路等。

圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.2 羅布麻對小鼠的影響

2.2.1 羅布麻對衰老小鼠一般情況的影響 與對照組小鼠比較，模型組小鼠出現(xiàn)精神萎靡，倦怠嗜睡，喜扎堆，進(jìn)食減少，毛色枯槁無光澤、易脫落，皮膚彈性差等衰老體征，羅布麻組小鼠上述情況改善。

2.2.2 羅布麻對衰老小鼠肝臟組織的影響 對照組小鼠肝小葉、匯管區(qū)等結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，無變性和壞死；模型組小鼠肝組織發(fā)生肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性、局灶壞死、驗(yàn)證細(xì)胞浸潤等退行性改變；羅布麻組小鼠肝組織肝細(xì)胞排列稍紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性、局灶壞死、驗(yàn)證細(xì)胞浸潤等退行性改變較模型組小鼠減輕（圖6）。

圖6 小鼠肝臟組織H-E 染色

2.2.3 羅布麻對衰老小鼠p53 表達(dá)的影響 采用Western 印跡法檢測羅布麻對關(guān)鍵靶點(diǎn)p53 表達(dá)的影響（圖7A、7B）：與對照組比較，模型組小鼠p53的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；羅布麻組小鼠p53 的表達(dá)水平上調(diào)，但低于模型組（P＜0.05）。采用免疫熒光檢測小鼠p53 的表達(dá)（圖7C）：羅布麻組p53 表達(dá)較模型組減弱。

圖7 小鼠肝臟p53 表達(dá)分析

3 討 論

3.1 羅布麻抗衰老機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測 本研究通過文獻(xiàn)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫篩選出金絲桃苷、木犀草素、蕓香苷、兒茶素、羅布麻寧等關(guān)鍵活性成分。在衰老大鼠模型中，金絲桃苷通過抑制自噬衰老進(jìn)程中的腎臟結(jié)構(gòu)老化、損傷，緩解其功能衰退［7］。蕓香苷可上調(diào)衰老相關(guān)基因叉頭框蛋 白O（forkhead box protein O，F(xiàn)oxO） 及 抗 氧化基因錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD） 和 過 氧 化 氫 酶（catalase,CAT）的表達(dá)，進(jìn)而提高高脂飲食飼養(yǎng)的果蠅對冷熱休克、饑餓應(yīng)激的抵抗能力，并延長其壽命［8-10］；木犀草素可上調(diào)sirtuin 1 和p53 的表達(dá)，進(jìn)而減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性細(xì)胞衰老［11］；兒茶素可提高機(jī)體的抗氧化能力，促進(jìn)大腦單胺能神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，改善衰老進(jìn)程中的腦功能和日常生活活動(dòng)能力［12］；羅布麻寧是天然的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原酶（NADH）氧化酶抑制劑，可通過調(diào)控一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達(dá)，調(diào)控衰老進(jìn)程中血管結(jié)構(gòu)老化和功能衰退［13-15］。

通過數(shù)據(jù)庫檢索篩選出85 個(gè)作用靶點(diǎn)，其中核心靶點(diǎn)為p53、AKT1、IL-6、INS。p53 是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、DNA 修復(fù)、衰老細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用［16］。在線蟲和小鼠衰老模型中發(fā)現(xiàn)，p53 通過負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬延緩衰老［17］。AKT 在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用，活化的AKT 通過磷酸化多種激酶和轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括p21、p27、Foxo 等衰老相關(guān)分子［18］。胰島素抵抗是衰老在代謝上的重要特點(diǎn)之一［19］，并進(jìn)一步介導(dǎo)衰老進(jìn)程中的炎癥環(huán)境改變［20］。衰老狀態(tài)下循環(huán)炎癥標(biāo)志物處于高水平，其中超過800 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄與IL-6 有關(guān)［21-22］。

通過KEGG 通路富集分析篩選出PI3K-AKT、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE、內(nèi)分泌抵抗、IL-17、TNF-α 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在衰老過程中調(diào)控細(xì)胞存活和凋亡、代謝、炎癥反應(yīng)等關(guān)鍵生物學(xué)過程。

3.2 羅布麻的抗衰老作用和靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 在以往羅布麻抗衰老研究［2-4,6］基礎(chǔ)上，本研究采用D-半乳糖皮下注射構(gòu)建衰老小鼠模型，觀察到羅布麻可改善衰老小鼠的一般衰老癥狀和體征，減輕衰老導(dǎo)致的肝臟組織病理學(xué)改變，抑制衰老進(jìn)程中肝臟組織p53 表達(dá)的上調(diào)。p53 作為一種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，通過結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域來上調(diào)或下調(diào)特定靶基因的表達(dá)，通過結(jié)合內(nèi)含子位點(diǎn)促進(jìn)選擇性轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控下游靶基因和效應(yīng)器。p53 及其調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)能促進(jìn)受損細(xì)胞的修復(fù)、存活或消除，在衰老過程中發(fā)揮重要作用。在不同的環(huán)境下，p53 可選擇性臨時(shí)阻止細(xì)胞分裂，啟動(dòng)DNA 修復(fù)機(jī)制，無法使DNA 修復(fù)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，或者進(jìn)入DNA復(fù)制性衰老狀態(tài)［23］。動(dòng)物模型中，衰老與p53 活化有關(guān)，p53 缺失則可抑制衰老表型的發(fā)生［24-25］。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了羅布麻抗衰老的多個(gè)成分和多個(gè)靶點(diǎn)，并通過動(dòng)物模型驗(yàn)證了羅布麻可能通過下調(diào)p53 的表達(dá)發(fā)揮其抗衰老作用，但其調(diào)控p53 的上游途徑，以及下游靶基因和效應(yīng)器尚有待進(jìn)一步探討。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。