川芎-天麻對硝酸甘油偏頭痛大鼠硬腦膜血漿蛋白外滲影響

劉露露 章正祥 韋欽 吳雨佳 于文靜 曹志堅

偏頭痛是世界排名第二的致殘性疾病［1］，全球年患病率約15%［2］。頻繁和嚴重的頭痛致患者生活質量嚴重下降。偏頭痛的機制與三叉神經血管反射學說密切相關，血漿蛋白外滲（plasma protein extravasation，PPE）在其中發揮重要作用。硬腦膜PPE是偏頭痛動物模型的關鍵病理指標之一，也是引發偏頭痛神經源性炎癥反應的一個重要特征［3］。近年來，中醫藥治療偏頭痛的作用不斷得到肯定，川芎、天麻是最常用的一個藥對，即《圣濟總錄》的大芎丸或《宣明論方》的大川芎丸。前期研究顯示，川芎-天麻可以有效改善頭痛，但對偏頭痛的影響尚未明確［4］。本研究旨在觀察川芎-天麻對硝酸甘油偏頭痛模型大鼠硬腦膜血漿蛋白外滲的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠36只，體質量180～220（232±12）g，購自杭州醫學院，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002。分籠飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012。飼養條件符合國家標準，自然晝夜，棒狀飼料喂養，自由飲水。研究方案獲得浙江中醫藥大學動物實驗中心倫理審批，批件號：IACUC-20200907-05。

1.2 藥品與試劑 妥泰購自西安楊森制藥有限公司（批號：KEJOKUL），天麻顆粒劑（批號：2003003S）、川芎顆粒劑（批號：1910004C）均購自華潤三九醫藥股份有限公司。硝酸甘油（批號：190506L）購自山東圣魯制藥有限公司。伊文思藍粉末（Lot.No 619N041，Cat.No E8010）、甘油明膠封片劑購自Lot.No 20200730，Cat.No S2150）均購自Solarbio公司。

1.3 儀器 激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）購于德國徠卡公司；電熱鼓風干燥箱（型號：DHG-9030A）購于上海-恒儀器有限公司；4 ℃醫用冰箱（型號：YC-968L）購于中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.4 實驗方法 （1）分組：36只雄性SD大鼠編號稱重，隨機分成4組，每組各9只，分別為對照組、模型組、妥泰組、川芎-天麻組。（2）灌胃與造模：對照組、模型組分別每日灌胃純水1 mL/100 g，妥泰組每日灌胃妥泰1 mL/100 g，川芎-天麻組每日灌胃川芎-天麻1 mL/100 g，連續給藥7 d，每日固定時間段灌胃1次。模型組、妥泰組、川芎-天麻組在第7天灌胃后于玻璃箱中適應，0.5 h后進行腹腔注射硝酸甘油（10 mg/kg，0.2 mL/100 g）造模，對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液（0.2 mL/100 g），造模后置于玻璃箱中，并于安靜環境下，在固定時間段通過攝像機錄像，進行行為學觀察，觀察指標為撓頭、理毛、爬籠、咬尾等，觀察行為學后根據計算好的時間對大鼠進行麻醉。（3）麻醉與取材：3 h后，按照時間分別給大鼠腹腔注射3%濃度戊巴比妥鈉進行麻醉（50 mg/kg，0.1667 mL/100 g）。待大鼠完全麻醉后，于鎖骨上方暴露右側頸外靜脈，從頸外靜脈緩慢注入2%伊文思藍（5 mg/100 g，0.25 mL/100 g），大鼠四肢末端、口、眼球、肝臟等組織可見藍染現象。1 h后對大鼠進行開胸，剪開大鼠胸骨，暴露心臟，右手持灌胃針頭刺入心尖，直至灌胃針進入主動脈，破壞右心耳，用止血鉗夾住并固定灌胃針，并用50 mL注射器連接灌胃針，隨后用0.9%氯化鈉溶液經心臟灌注300～350 mL，即可見流出液體澄清。然后對大鼠進行斷頭開顱，立即小心完整分離硬腦膜。

1.5 觀察指標 將取出的硬腦膜用去離子水沖洗3～4次，平鋪于載玻片上，置于37℃烘箱中15～20 min烘干，用甘油明膠封片劑封片，然后使用激光共聚焦顯微鏡在100倍鏡下拍攝雙側硬腦膜血漿蛋白滲出情況。熒光波長設在670～740 nm，紅光（638）：1%，其余設置均不變。拍攝區域主要定在腦膜中動脈各分支交叉處，分支及主干交叉處，選定面積大小為40,000～80,000 μm2，每張硬腦膜標本雙側各取3個拍攝區域，用image j計算各個選定的灰度值均值。計算公式為：灰度值均值=灰度值（IntDen）/面積（area）。

1.6 統計學方法 采用SPSS25.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 硝酸甘油偏頭痛大鼠硬腦膜伊文思藍染色 見圖1。

圖1 硝酸甘油偏頭痛大鼠硬腦膜伊文思藍染色（×100）

2.2 與對照組比較，模型組硬腦膜血漿蛋白外滲明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，妥泰組（P=0.031）和川芎-天麻組（P＜0.001）硬腦膜血漿蛋白外滲均明顯降低，且川芎-天麻組優于妥泰組，差異有統計學意義。見圖2。

圖2 川芎-天麻對硝酸甘油偏頭痛大鼠硬腦膜血管通透性影響比較

3 討論

偏頭痛是原發性頭痛中最常見的類型，發病機制尚未完全明確，胃腸神經功能障礙交互混合，發作頻繁［5］，治療困難。隨著社會的發展，現代人的壓力越來越大，生活節奏越來越快，偏頭痛的發病率日趨上升，而且女性發病率遠遠高于男性［6］。偏頭痛在中醫理論上中屬于“頭風”“頭痛”“厥頭痛”等范疇，“頭痛”一詞首載于《黃帝內經》，且認為其病因與風有關。中醫對偏頭痛的認識不斷完善，而且中藥治療偏頭痛有豐富的經驗和獨特的優勢，可以預防偏頭痛發作，還可有效緩解偏頭痛癥狀。川芎［7］、天麻［8］具有顯著的抗炎鎮痛、神經保護、抗氧化作用。川芎有效成分［9］和天麻素［10］均可改善腦部循環，增加腦血流量，緩解頭痛發作。有研究表明，川芎、天麻治療血管性頭痛的有效率可達80%以上，川芎-天麻中的有效成分具有良好的抗炎鎮痛作用，并且可以改善微循環、擴張腦血管，調節與保護血管舒張功能，還可以起到保護神經的作用［11］。偏頭痛的發病機制與顱內血管密切相關，川芎、天麻均可以作用于腦部血管，調節腦循環等作用來緩解頭痛，基于川芎-天麻的以上作用，此藥對可有效防治偏頭痛。

目前關于偏頭痛的發病機制比較復雜，在眾多學說中，主要傾向于三叉神經血管學說，其次是皮質擴散抑制（cortical spreading depression，CSD）學說。在三叉神經血管學說中，偏頭痛的發病與三叉神經血管系統（trigeminal vascular system，TGVS）的激活密不可分，各種刺激作為偏頭痛的觸發點，隨后導致CSD，然后激活TGVS，致使三叉神經末梢釋放血管活性物質如降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、P物質等［12］。TGVS激活還可導致一系列神經源性炎癥（neurogenic inflammation，NI）的反應，如神經源性硬腦膜血管的擴張（neurogenic dural vasodilatation，NDV）、腦膜肥大細胞腫脹脫顆粒和硬腦膜PPE等，從而引起痛覺超敏反應，引發偏頭痛［3］。

本研究采用腹腔注射硝酸甘油建立血管舒縮異常偏頭痛大鼠模型，有研究發現，硝酸甘油可以通過刺激大鼠神經末梢釋放血管活性物質，這種釋放引起腦膜血管舒張，使硬腦膜血漿蛋白滲出增加，并釋放白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β等，致使大鼠發生神經源性炎癥偏頭痛［13］。本實驗建立的硝酸甘油偏頭痛模型大鼠硬腦膜血漿蛋白外滲明顯升高，與文獻符合。

本研究顯示模型組和對照組相比，模型組血漿蛋白滲出明顯升高。與模型組相比，川芎-天麻組和妥泰組均能夠顯著降低硬腦膜血漿蛋白的滲出，且川芎-天麻組優于妥泰組，提示川芎-天麻、妥泰可能通過抑制血管擴張，從而抑制PPE，發揮抗神經源性炎癥作用，有效緩解硝酸甘油造成的大鼠炎癥性偏頭痛。本研究證實了川芎-天麻對PPE有一定程度的抑制作用，川芎-天麻通過作用于顱內血管這一靶點對偏頭痛起到預防性治療作用。

在頭痛治療中，引經藥使用是中醫治療頭痛的特點與優勢。頭痛或者伴隨癥狀的緩解是偏頭痛現代治療所有藥物的作用靶點。頭痛性質多樣，或脹痛，或刺痛，或隱痛，中醫可根據疼痛性質給予相應的加減，川芎、天麻活血行氣，對脹痛，刺痛有較好的療效。頭痛部位或左，或右，或前額，或后項，部位不一。《湯液本草》曰：“頭痛需用川芎，如不愈者各加引經藥。太陽川芎，陽明白芷，少陽柴胡，太陰蒼術，少陰細辛，厥陰吳茱萸。”頭痛引經藥根據頭痛經絡循行部位，引藥入病所，增加療效。川芎引藥入太陽、少陽兩經《中醫內科學》（新世紀第五版），天麻為足厥陰專藥。川芎天麻合用，覆蓋巔頂、兩側、后項部頭痛。川芎-天麻可看作引經藥來治療偏頭痛，通過預防性用藥，改善偏頭痛患者頭痛發作的嚴重程度，降低偏頭痛發作的頻率，減緩每次頭痛的持續時間等臨床癥狀，其具體作用機制還有待于進一步研究。

綜上所述，本研究以臨床常用中藥川芎-天麻藥對為對象，通過動物實驗研究，得出川芎-天麻能夠降低硬腦膜血漿蛋白的滲出，抑制大鼠神經源性炎癥，有效緩解硝酸甘油造成的大鼠炎癥性偏頭痛。研究結果也為川芎-天麻制劑對偏頭痛的治療提供一定的實驗依據。