胰高血糖素樣肽1通過circRNADOCK1/miR-132-3p信號軸調(diào)控胰島β細(xì)胞分泌功能的研究

胡金華 王婧 汪日紅 卓莉莉 張秋玲

2型糖尿病是常見的慢性疾病，據(jù)調(diào)查研究顯示2017年全球糖尿病患者已高達(dá)4.51億，給個(gè)人生活質(zhì)量及社會(huì)醫(yī)療帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［1-2］。目前已有充分的證據(jù)顯示，胰島β細(xì)胞受損在2型糖尿病發(fā)病中扮演重要角色［3-4］，因此采取有效的治療藥物改善胰島β細(xì)胞分泌。GLP-1類似物可一定程度上促進(jìn)機(jī)體胰島素的釋放，改善胰島β細(xì)胞的功能［5］，但具體涉及的作用機(jī)制尚不明確。目前已發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)控非編碼RNA miR-132表達(dá)水平提升胰島β細(xì)胞中的葡萄糖和GLP-1誘導(dǎo)的胰島素分泌，影響胰島功能［6］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一大類共價(jià)閉合環(huán)狀非編碼RNA，不受核酸外切酶的影響而具有高度穩(wěn)定性。課題組前期對糖尿病大鼠胰腺細(xì)胞組織進(jìn)行circRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)circRNADOCK1呈異常表達(dá)，與其他circRNA類似，其具有海綿樣吸附作用，含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可作為競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控下游miRNA表達(dá)。本研究將圍繞這個(gè)問題進(jìn)一步了解GLP-1類似物改善胰島功能的作用機(jī)制，為防治2型糖尿病提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 艾塞那肽（美國MCE公司）；大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞（美國ATCC公司）；胎牛血清和RPMI-1640（美國Gibco公司）；胰島素檢測試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；RNA提取試劑Trizol、DMSO、DEPC水、Lipofectamine 2,000（美國Invitrogen公司）；SYBR Premix Ex Taq qPCR試劑盒（日本Takara公司）；CCK-8檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；引物（上海生物工程公司）；熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Prome公司）；circRNADOCK1過表達(dá)載體（廣州自吉賽生物公司）；siRNA-circRNADOCK1（銳博生物公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將INS-1細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2、21% O2氣體的恒溫恒濕環(huán)境中。25 mmoL/L的葡萄糖處理INS-1細(xì)胞24 h后將細(xì)胞分為6組：①對照組：不做任何處理；②GLP-1類似物組：給予GLP-1類似物艾塞那肽處理48 h；③circRNADOCK1 siRNA組：轉(zhuǎn)染circRNADOCK1siRNA，干擾表達(dá)；④circRNADOCK1過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)circRNADOCK1載體，上調(diào)circRNADOCK1表達(dá)；⑤GLP-1類似物+circRNADOCK1 siRNA組：先 用 艾 塞 那 肽 處 理48 h，再 轉(zhuǎn) 染circRNADOCK1siRNA；⑥GLP-1類似物+circRNADO CK1過表達(dá)組：先用艾塞那肽處理48 h，再轉(zhuǎn)染過表達(dá)circRNADOCK1載體。（2）GLP-1類似物處理細(xì)胞：加入100 nmol/L艾塞那肽10 μL至高糖處理后的INS-1細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3）circRNADOCK1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染：過表達(dá)circRNADOCK1的慢病毒載體及空載體，采用感染復(fù)數(shù)（MOI）=20作為轉(zhuǎn)染條件，取INS-1細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。circRNADOCK1過表達(dá)慢病毒經(jīng)擴(kuò)增、鑒定、純化后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞長至80%時(shí)，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，然后吸出培養(yǎng)液，加入circRNADOCK1過表達(dá)慢病毒或空白載體慢病毒轉(zhuǎn)染液，在37 ℃、5%CO2、21%O2的細(xì)胞孵箱培養(yǎng)1 h后棄轉(zhuǎn)染液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。（4）circRNADOCK1 siRNA轉(zhuǎn)染：待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將circRNADOCK1 siRNA與si-NC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒按轉(zhuǎn)染說明分別轉(zhuǎn)染于INS-1細(xì)胞中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。（5）氯化鉀刺激的胰島素分泌（KSIS）功能實(shí)驗(yàn)及胰島素測定：經(jīng)不同處理后的細(xì)胞先棄去培養(yǎng)上清，用PBS漂洗一次，加入KRBH緩沖液（krebs-ringer bicarbonate HEPES Buffer）培養(yǎng)1 h；棄去上清，INS-1細(xì)胞中加入含有3.3 mmol/L（低糖）或者50.0 mmoL/L KCl（高鉀）的KRBH緩沖液，孵育1 h，收集上清，待測；PBS再漂洗一次，每孔細(xì)胞加入200 μL酸乙醇，4 ℃抽提過夜，取上清用于檢測；放免法（RIA）用試劑盒檢測各組細(xì)胞胰島素水平。（6）CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖：取各組處理后處于對數(shù)生長期的INS-1細(xì)胞，以每孔1,000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，并分別在0、6、12、24、36、48 h時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8試劑，37 ℃環(huán)境中孵育1 h，熒光酶標(biāo)儀在450 nm條件下測定吸光度（A）值，繪制生長曲線。（7）實(shí)時(shí)定量PCR檢測circRNADOCK1和miR-132-3p表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞RNA，測定濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成，以β-actin為內(nèi)參照，將cDNA模板、SYBR Green預(yù)混液、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反應(yīng)溶液，置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min預(yù)變性，然后按95℃ 30 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。通過2-△△CT法分析基因相對表達(dá)量。PCR引物序列，見表1。（8）雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：以pGL3-promoter為載體，構(gòu)建包含circRNADOCK1與miR-132-3p潛在結(jié)合序列的重組質(zhì)粒pGL3-circRNADOCK1和包含相應(yīng)結(jié)合序列突變的pGL3-circRNADOCK1-mut，將重組質(zhì)粒和miR-132-3p共轉(zhuǎn)染至INS-1細(xì)胞中，根據(jù)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度比值（FL/RL）的改變判斷circRNADOCK1與miR-132-3p是否存在結(jié)合作用。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)；兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞KSIS功能比較 與對照組比較，GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組細(xì)胞的KSIS功能明顯上升（P＜0.05），circRNADOCK1過表達(dá)組明顯下降（P＜0.05）；與GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1 siRNA組增加更為明顯（P＜0.05）；與circRNADOCK1過表達(dá)組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1過表達(dá)組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞KSIS功能比較

2.2 各組細(xì)胞胰島素含量比較 與對照組比較，GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組胰島素含量明顯上升（P＜0.05），circRNADOCK1過表達(dá)組明顯下降（P＜0.05）；與GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1 siRNA組增加更為明顯（P＜0.05）；與circRNADOCK1過表達(dá)組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1過表達(dá)組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞胰島素含量比較

2.3 各組細(xì)胞增殖率比較 與對照組比較，GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組增殖率明顯增加（P＜0.05），circRNADOCK1過表達(dá)組明顯下降（P＜0.05）；與GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1 siRNA組增加更為明顯（P＜0.05）；與circRNADOCK1 過表達(dá)組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1過表達(dá)組明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞增殖率比較

2.4 各組circRNADOCK1 mRNA和miR-132-3p mRNA表達(dá) 與對照組比較，GLP-1類似物組與circ RNADOCK1 siRNA組的circRNADOCK表達(dá)明顯下降，miR-132-3p表達(dá)明顯增加（P＜0.05），circRNADOCK1過表達(dá)組circRNADOCK表達(dá)明顯增加，miR-132-3p表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與GLP-1類似物組與circRNADOCK1 siRNA組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1 siRNA組circRNADOCK表達(dá)下降更為明顯，miR-132-3p表達(dá)增加更為明顯（P＜0.05）；與circRNADOCK1過表達(dá)組比較，GLP-1類似物+circRNADOCK1過表達(dá)組circRNADOCK表達(dá)明顯下降，miR-132-3p表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組circRNADOCK1 mRNA和miR-132-3p mRNA相對表達(dá)量

2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRNADOCK1與miR-132-3p的結(jié)合作用 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pGL3-circRNADOCK1-MUT重組質(zhì)粒比較，pGL3-circRNADOCK1-WT的細(xì)胞FL/RL值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

3 討論

2型糖尿病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的內(nèi)分泌代謝疾病，其主要病因是胰島β細(xì)胞受損導(dǎo)致機(jī)體胰島素抵抗。因此，修復(fù)受損胰島β細(xì)胞是治療2型糖尿病的基礎(chǔ)。隨著GLP-1類似物的逐漸應(yīng)用，其在臨床上受到廣泛關(guān)注，主要通過與胰腺β細(xì)胞中表達(dá)的GLP-1受體結(jié)合對β細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。然而，GLP-1類似物調(diào)控β細(xì)胞功能中的下游分子機(jī)制仍有待充分理解。

隨著非編碼RNA的不斷發(fā)現(xiàn)和闡明，其在胰島β細(xì)胞中的功能和機(jī)制逐步被揭示，以胰島β細(xì)胞為中心的miRNAs和環(huán)狀RNA的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸豐富［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中circRNADOCK1發(fā)揮海綿吸附作用，與miR-132具有結(jié)合位點(diǎn)，通過調(diào)控其表達(dá)發(fā)揮促癌作用，細(xì)胞分裂貢獻(xiàn)者（DOCK）家族成員，circRNADOCK1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中其關(guān)鍵作用［9-11］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠胰腺細(xì)胞circRNADOCK1表達(dá)異常升高，但其在GLP-1調(diào)控miR-132的過程中發(fā)揮何種作用尚未研究報(bào)道，故本研究采用高糖刺激大鼠INS-1細(xì)胞模擬胰島細(xì)胞受損，隨后采用不同干預(yù)手段，分析其對胰島分泌功能和胰島素的影響。結(jié)果顯示，艾塞那肽和circRNADOCK1 siRNA提升細(xì)胞KSIS功能和胰島素含量，而circRNADOCK1 oeRNA則降低細(xì)胞KSIS功能和胰島素含量。初步表明circRNADOCK1升高在胰島β細(xì)胞功能受損中的作用，而降低其表達(dá)有助于改善胰島β細(xì)胞功能。但至此，仍不清楚GLP-1與circRNADOCK1的調(diào)控關(guān)系，為了進(jìn)一步明確兩者的作用，本研究在上述干預(yù)基礎(chǔ)上采用功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)，即在干擾和過表達(dá)circRNADOCK1的基礎(chǔ)上分別聯(lián)合艾塞那肽。結(jié)果顯示，干擾circRNADOCK1和艾塞那肽共處理后，細(xì)胞胰島分泌功能和胰島素增加更為明顯，而circRNADOCK1過表達(dá)與艾塞那肽共處理后，明顯逆轉(zhuǎn)circRNADOCK1過表達(dá)引起的降低和艾塞那肽的升高；同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的circRNADOCK1和miR-132-3p mRNA表達(dá)結(jié)果則是進(jìn)一步驗(yàn)證了GLP-1與circRNADOCK1，這充分表明GLP-1與circRNADOCK1存在直接的調(diào)控作用，且可通過circRNADOCK1調(diào)控miR-132-3p表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)則驗(yàn)證了circRNADOCK1與miR-132-3p具有結(jié)合位點(diǎn)。

綜上所述，胰高血糖素樣肽1（GLP-1）通過circRNADOCK1/miR-132-3p信號軸調(diào)控胰島β細(xì)胞分泌功能。在下一步工作中，課題組將繼續(xù)深入研究相關(guān)機(jī)制，為2型糖尿病的防治提供新的思路。