漢黃芩苷通過調控AKT信號通路促進肝癌細胞HepG2凋亡的研究

李鑫芳 鄭偉 葉昂直

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，主要發生于肝細胞或肝內膽管細胞［1］。尋找能夠有效抑制肝癌細胞增殖的小分子物質可為肝癌的治療提供新的治療藥物，同時有望改善肝癌患者的預后。近年來，中藥單體及衍生物已被證明在多種癌癥模型中發揮抗癌作用［2-3］。漢黃芩苷為黃芩中特有成分，其在癌癥治療中的作用逐漸為人所熟知。CHEN等［4］研究結果顯示，漢黃芩苷通過ERhippo信號軸抑制子宮內膜癌的腫瘤生長和轉移。YAO等［5］研究顯示，漢黃芩苷通過抑制TRAF2/4的表達抑制乳腺癌的侵襲和遷移。本研究擬通過體外實驗闡明漢黃芩苷在肝癌治療中的作用及其分子調控機制，研究漢黃芩苷對肝癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）細胞株：人肝癌細胞HepG2由中國科學院上海生命科學院細胞資源中心提供。（2）試劑與儀器：漢黃芩苷購于上海源葉生物科技有限公司；AKT特異性激動劑SC79購于MCE公司；兔抗小鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體購于Abcam公司；兔抗小鼠GAPDH、Caspase-3、Akt、p-Akt單克隆抗體與山羊抗兔IgG二抗購于CST公司；DMEM高糖培養基購于Gibco公司；BCA蛋白檢測試劑盒購于碧云天公司；凝膠成像分析系統、電泳槽購于Bio-Rad公司；CO2培養箱購于Salvis Lab公司；MultiskanTM FC型酶標儀購于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法 （1）細胞培養：用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基處理并培養于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中。（2）細胞增殖實驗：用胰酶消化肝癌細胞HepG2，離心后將細胞重懸，制備肝癌細胞HepG2懸液并計數細胞數量將肝癌細胞HepG2稀釋至合適的鋪板細胞數后接種到96孔板內，待肝癌細胞HepG2貼壁后給予不同濃度的漢黃芩苷處理，每個濃度設置3個復孔，并置于37 ℃培養箱中培養24 h。最后，向每個孔內加入10 μL CCK-8試劑，測定450 nm處的吸光度并統計分析。（3）Western blot實驗：通過蛋白裂解液對肝癌細胞進行裂解，冰上靜置30 min后放入離心機中以12,000 r/min離心30 min，收集上清液并檢測總蛋白濃度，用10%分離膠分離蛋白樣本，在300 mA電流條件下轉膜，封閉2 h，放入GAPDH（1∶5,000）、AKT（1∶1,000）、p-AKT（1∶1,000）、Caspase-3（1∶1,000）、Bax（1∶1,000）和Bcl-2（1∶1,000）一抗稀釋液中孵育過夜。第二天，用TBS-Tween洗滌3次后，二抗稀釋液孵育2 h并再次洗滌3次，曝光各蛋白條帶并用Image Lab軟件分析條帶灰度值。Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白以GAPDH蛋白條帶作內參照；p-AKT蛋白分別以AKT蛋白條帶作參照。（4）流式細胞學實驗：給予肝癌細胞HepG2漢黃芩苷和AKT激動劑處理后，用10 mL的離心管收集肝癌細胞，將細胞濃度控制在3×106/mL，以1,000 r/min速度離心5 min，棄去上清液，用孵育緩沖液洗滌1次，再次離心。用100 μL標記溶液重懸肝癌細胞，在室溫避光環境下孵育15 min，再次離心和洗滌肝癌細胞1次，向肝癌細胞內加入熒光溶液并孵育于4 ℃環境中20 min。最后，調節系統參數通過流式細胞分析儀進行相應的檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漢黃芩苷劑量依賴性抑制肝癌細胞HepG2增殖能力 CCK-8實驗結果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可抑制肝癌細胞的增殖能力，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同劑量漢黃芩苷處理對肝癌細胞HepG2細胞增殖能力比較

2.2 漢黃芩苷激活肝癌細胞HepG2凋亡反應 Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可顯著上調肝癌細胞內凋亡相關蛋白Casepase-3和Bax的表達水平，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。與此同時，給予AKT特異性激動劑SC79處理后肝癌細胞內凋亡相關蛋白caspase-3和Bax的表達水平與漢黃芩苷治療組相比顯著降低，而抗凋亡相關蛋白Bcl-2的表達水平顯著增加,差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 漢黃芩苷對肝癌細胞內Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較

2.3 漢黃芩苷促進肝癌細胞HepG2凋亡程度 流式細胞學實驗結果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可顯著促進肝癌細胞的凋亡程度,差異有統計學意義（P＜0.05）。與此同時，給予AKT特異性激動劑SC79處理后，漢黃芩苷對肝癌細胞凋亡程度的促進作用與漢黃芩苷治療組相比受到顯著抑制，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 漢黃芩苷對肝癌細胞HepG2凋亡水平比較

2.4 漢黃芩苷通過調控AKT信號通路促進肝癌細胞凋亡 Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可顯著抑制肝癌細胞內AKT蛋白磷酸化水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。與此同時，給予AKT特異性激動劑SC79處理后，肝癌細胞內AKT蛋白磷酸化水平與漢黃芩苷治療組相比顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 漢黃芩苷對肝癌細胞內AKT蛋白磷酸化水平比較

3 討論

隨著我國肝病人數的增加，PHC的發病人數逐年增加，PHC已經成為嚴重威脅我國人民健康的消化道惡性腫瘤之一。PHC主要有三種不同的病理類型，包括肝細胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）、肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCCICC混合型。HCC的發病率最高，占總數的85%～90%。該病起病隱匿，早期無明顯不適，一旦出現典型的臨床癥狀和體征顯示已進入疾病的中晚期，因此肝癌患者的5年生存率較低。隨著分子靶向藥物研發速度的加快，患者的5年生存率取得了大幅的提升，但由于腫瘤靶向藥物的適用人群較為狹隘且治療費用普遍較為昂貴，因此絕大部分肝癌患者的生存率仍較低［6］。尋找更多能夠有效抑制癌癥細胞增殖且價格低廉的抗癌藥物可進一步改善肝癌患者的遠期療效。本課題組主要研究漢黃芩苷在抑制肝癌細胞HepG2增殖、促進肝癌細胞HepG2凋亡過程中的作用以期為漢黃芩苷治療肝癌提供實驗依據。

漢黃芩苷對癌癥細胞生長的抑制作用已在多項基礎研究中被證實，且抑制癌癥細胞增殖和誘導癌癥細胞死亡是其發揮抗癌作用的主要方式。LUO等［7］研究結果顯示，漢黃芩苷可通過促進線粒體功能障礙誘導人非小細胞肺癌A549細胞凋亡。WANG 等［8］研究結果顯示，漢黃芩苷通過調節Bcl-2和Bax誘導骨肉瘤細胞周期阻滯和線粒體介導的細胞凋亡。GU等［9］研究結果顯示，漢黃芩苷通過調控IRE1α通路促進人胃癌細胞凋亡和內質網應激。本研究中，CCK-8實驗結果顯示，漢黃芩苷對肝癌細胞HepG2增殖能力具有顯著的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，肝癌細胞HepG2的增殖能力受到更加顯著的抑制。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡，通過促進癌癥細胞凋亡可延緩癌癥的進展，減少癌細胞對周圍組織的侵襲，從而達到治療癌癥的目的。Western blot實驗結果顯示，漢黃芩苷可上調肝癌細胞內凋亡相關蛋白Bax和Caspase-3蛋白表達水平，同時下調Bcl-2蛋白表達水平。流式細胞學實驗結果顯示，漢黃芩苷可誘導肝癌細胞凋亡。上述研究結果顯示，漢黃芩苷可通過抑制肝癌細胞增殖、促進細胞凋亡，從而發揮治療肝癌的作用。

為了進一步明確漢黃芩苷促進肝癌細胞HepG2凋亡的信號調控機制，給予漢黃芩苷治療的肝癌細胞AKT激動劑處理。有研究顯示，AKT通路參與了細胞凋亡的調控過程。FRANKE 等［10］研究發現，AKT相關蛋白在細胞凋亡中的調控作用。HAN 等［11］研究發現，漢黃芩苷通過PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路抑制細胞生長，誘導線粒體介導的人結腸癌細胞自噬相關凋亡。本研究中Western blot結果顯示，漢黃芩苷可有效抑制肝癌細胞HepG2內AKT蛋白磷酸化水平。給予AKT激動劑處理上調肝癌細胞HepG2內AKT蛋白磷酸化水平后漢黃芩苷對肝癌細胞HepG2凋亡的促進作用受到顯著的抑制。由此可見，AKT信號通路在漢黃芩苷促進肝癌細胞HepG2凋亡過程中發揮重要的調控作用。

綜上所述，漢黃芩苷通過調控肝癌細胞HepG2 AKT信號通路，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖發揮其抗癌作用。