遠志皂苷調控Aβ轉運抑制神經細胞周期活化及細胞凋亡的作用

余河漢 陸曉華 金桂芳 楊紅

(廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(AD)是一種伴有認知能力和學習記憶能力嚴重減退的慢性中樞神經系統退行性疾病。β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積導致的神經毒性是AD的致病機制之一，有研究顯示，腦中Aβ沉積聚集而成的老年斑是AD病理過程的關鍵性事件〔1〕。Aβ主要由淀粉樣蛋白前體(APP)水解產生，正常情況下〔2,3〕，在大腦中，Aβ可以雙向運輸穿過血腦屏障(BBB)，其流出和流入都由極化的BBB受體和轉運蛋白控制，同時 Aβ的積累不僅是由于BBB的清除率降低，而且還與循環系統的攝取增加有關。低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)1在大腦和肝臟中大量表達，參與大腦和Aβ的全身清除，LRP1的功能障礙可能削弱BBB的清除能力。位于內皮腔膜的晚期糖基化終產物(RAGE)受體將Aβ從循環中穿梭進入大腦進行晚期糖基化。 因此，LRP1和RAGE被認為是負責腦中Aβ平衡的兩個主要受體。但當這種受體轉運異?；駻PP基因過表達時，將引起腦內Aβ清除減少，導致Aβ的異常聚集和沉積。研究發現〔4〕，Aβ的沉積可通過刺激細胞周期相關蛋白表達，導致終末分化的神經細胞周期再活化而失調，促使神經元凋亡。遠志皂苷(Ten)是中藥遠志的主要活性成分，研究表明〔5～7〕，Ten能抑制Aβ導致的神經毒性，具有抗氧化、抗衰老、抗癡呆等作用，但作用機制不明確。本文通過研究Ten調節Aβ的轉運清除，探討其抑制Aβ導致的細胞周期紊亂及細胞凋亡的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 Ten(大連美侖生物技術有限公司)；Aβ25～35(Sigma公司)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-8活性檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)；兔抗鼠β-actin、羊抗兔二抗、兔抗鼠LRP1、兔抗鼠RAGE、兔抗鼠p21、兔抗鼠CyclinD1、E2F1(Abcam 公司)；羊抗兔IgG(γ-chain specific,博士德公司);M450 型 ELISA Reader 酶標儀(美國 Bio-Rad)；水平電泳儀、垂直電泳儀、蛋白轉印儀(北京百晶生物技術有限公司)；倒置顯微鏡(德國 Leica)。

1.2細胞培養 將PC12細胞常規解凍并在含有10%新生胎牛血清、100%青霉素和100%鏈霉素的RPMI1640 培養液中在37℃下5%CO2濕潤的環境中生長。培養基每周更換2～3次。待細胞豐度達80%后用0.25%胰酶消化傳代培養，將細胞用于下一步驟。

1.3藥物處理及實驗分組 按之前的實驗〔8〕，以Aβ25～3520 μmol/L作為造模處理劑量。實驗設為對照組、Aβ組、Ten組(50、100、200、400 μmol/L)，檢測細胞活力，選取Ten 100 μmol/L作為最佳給藥劑量進行后期實驗指標測定。

1.4Western印跡測蛋白表達 細胞周期相關蛋白提取的樣品需按常用的血清饑餓法處理，使PC12細胞同步化于G0 期。轉運蛋白提取的樣品常規處理。然后加入裂解緩沖液機械均化裂解細胞。將樣品在14 000 r/min，4℃下離心10 min，收集上清液。通過二喹啉甲酸(BCA)測定法定量蛋白質提取物，并將其等量加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上。通過半干轉移將分離的樣品轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉溶液封閉后分別加入一抗(RAGE、LRP1、β-actin、p21、CyclinD1、E2F1)，4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，在與相應的辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體溫育后，觀察條帶并將信號標準化為β-肌動蛋白作為內標，暗室進行曝光、顯影與定影，并分析。

1.5噻唑藍(MTT)法測細胞活力 細胞按以下分組處理：新鮮完全培養基；Aβ組(20 μmol/L Aβ25～35)；20 μmol/L Aβ25～35+50 μmol/L Ten組；20 μmol/L Aβ25～35+100 μmol/L Ten組；20 μmol/L Aβ25～35+200 μmol/L Ten組；20 μmol/L Aβ25～35+400 μmol/L Ten組。于CO2恒溫培養箱持續24 h培養。24 h后棄去上清，將MTT(10 μl，5 mg/ml)加入每個培養孔中，在37℃下保持4 h。小心除去培養基并在每個孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置于低速搖床振蕩10 min。最后，通過使用波長為492 nm的酶標儀評估吸光度A值。每組設置5個復孔，設不加細胞的空白調零孔，平行實驗3次，按常規公式計算，計算平均值，得出細胞存活率。

1.6RT-qPCR檢測細胞凋亡因子B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)及Caspase蛋白酶的表達水平 用Trizol提取收集的細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度；RNA逆轉錄獲得cDNA，再以適量cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40次。引物：Caspase-3上游引物5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-GAGACAG-ACAGTGGAACTGACGATG-3′；Caspase-8上游引物5′-GAGCTGCCAGTTTCTGTTTTG-3′，下游5′-GTTGAAGATCAGACAGTACCCC-3′；Bcl-2上游引物5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-ACAGCC-AGGAGAAATCAAACA-3′；Bax上游引物5′-ACGCATCCACCAAGAAGC-3′，下游5′-GCCACACGGA-AGAAGACCT-3′；β-actin上游引物5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.7Caspase-3和Caspase-8酶活力檢測 充分裂解細胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。按照試劑盒說明書測Caspase-3、Caspase-8的酶活性。同時取少量樣品，Bradford法測定蛋白濃度，使蛋白濃度達到1～3 mg/ml。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，兩組間比較用t檢驗。

2 結 果

2.1Ten調節Aβ誘導損傷后PC12細胞活力 與對照組〔(100.00±1.42)%〕相比，Aβ組PC12細胞存活率明顯降低〔(44.77±1.45)%，P<0.01〕，與Aβ組相比，不同濃度Ten對Aβ25～35誘導的PC12細胞存活率均有影響，50、100、200 、400 μmol/L Ten 藥物組的細胞存活率明顯升高〔(56.61±1.66)%、(61.97±1.65)%、(53.22±1.88)%、(46.03±1.79)%、均P<0.01〕。

2.2Ten調節Aβ轉運蛋白LRP1和RAGE表達 與對照組相比，Aβ組細胞LRP1表達明顯減少，RAGE表達明顯增多(P<0.01)；與Aβ組相比，Ten組細胞LRP1表達明顯增多(P<0.01)，RAGE表達明顯減少(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 Ten對Aβ誘導的PC12細胞LRP1與RAGE蛋白表達的影響

圖1 Western印跡檢測LRP1與RAGE蛋白表達

2.3Ten抑制Aβ誘導的細胞周期活化 與對照組相比，Aβ組細胞p21蛋白表達明顯降低，CyclinD1和E2F1蛋白表達明顯升高(均P<0.01)；與Aβ組相比，Ten組細胞p21蛋白表達明顯升高，CyclinD1和E2F1蛋白表達明顯降低(均P<0.01)。見圖2、表2。

2.4Ten對Aβ誘導的PC12細胞Bcl-2、Bax基因mRNA表達水平的影響 與對照組相比，Aβ組Bcl-2表達明顯下降，Bax表達明顯上升(P<0.01)；而使用Ten 干預后，Bcl-2和Bax的基因表達得到逆轉(P<0.01)。見表3。

2.5Ten對Aβ誘導的細胞Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達水平及酶活力的影響 與對照組相比，Aβ組Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達水平明顯升高及酶活力明顯增強(P<0.01)，與Aβ組比較，Ten組Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達及酶活力明顯下降(P<0.01)。見表3。

圖2 Western印跡檢測p21、CyclinD1及E2F1蛋白表達

表2 Ten對Aβ誘導的PC12細胞p21、CyclinD1及E2F1蛋白表達的影響

表3 Ten對Aβ誘導的PC12細胞Bcl-2與Bax mRNA表達、Casapse-3與Caspase-8 mRNA及酶活力的影響

3 討 論

AD是由多種原因共同作用導致的病理機制復雜的老年疾病，“Aβ沉積及其神經毒性”被認為是AD發病關鍵環節中的重要因素。正常情況下，腦內Aβ的產生和清除處于動態平衡，而在神經系統功能出現異常時，腦內Aβ的清除能力降低30%，導致Aβ在腦內異常集聚，損害大腦認知功能，加劇AD病程〔9，10〕。Aβ的清除方式主要有以下四種：跨BBB轉運清除、降解酶降解、小膠質細胞吞噬和細胞自噬，其中以通過BBB轉運機制將Aβ轉出腦組織進入到外周血液并進行清除為主，該途徑主要由LRP1、RAGE介導〔11,12〕。當腦內Aβ形成異常時，RAGE與LRP1的表達水平直接影響Aβ的轉運清除〔12〕。本實驗結果顯示，Ten可以通過上調LRP1和下調RAGE的表達而加快Aβ的轉運及清除，減少神經細胞內Aβ沉積。

在探索AD病理機制中,研究人員發現AD 病人腦內的神經元中出現細胞周期重啟，Aβ形成聚集沉積與細胞周期紊亂有關，研究中還發現周期相關蛋白的異常表達〔13～15〕，細胞周期調控異常會導致細胞功能障礙甚至死亡。神經細胞為終末分化細胞，正常情況下神經細胞不再進入細胞周期，應該停留在G0期，異常重新進入細胞周期便會導致神經細胞的變性損傷，甚至凋亡〔16〕，而不是細胞增殖。p21是具有廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白，研究證實〔17〕，Aβ的過量沉積會使p21表達水平下調，接著導致CyclinD1表達水平上調，從而活化和結合周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4，形成CyclinD1/CDK4復合物，進而磷酸化Rb，釋放E2F1，最后造成神經細胞突破細胞周期限制點，異常進入G1期。E2F1是細胞轉錄活化因子，在G1至S期的調控中可直接活化許多DNA合成基因和細胞生長控制基因，能高強度的促使細胞進入S期〔18～20〕。細胞周期進程可被內源性抑制物p21阻斷，負性調節CDKs的激活從而調控周期各時期的轉換。本實驗結果顯示，Aβ25～35誘導 PC12細胞后，p21蛋白表達下調，CyclinD1及E2F1的蛋白均上調，該結果與上述文獻報道相符。而Ten作用后，可上調p21蛋白表達，下調CyclinD1及E2F1的蛋白表達，提示Ten通過負性調節CDKs 的激活而調控周期，從而抑制Aβ介導的神經細胞周期活化。

Aβ具有神經毒性，在腦內異常聚集時，會破壞神經元細胞膜，導致細胞通透性增加，Ca2+會大量涌入細胞內，誘發脂質氧化等一系列不良反應〔21〕，進而影響凋亡基因Bcl-2家族及Caspase家族的表達，最終引起神經細胞凋亡〔22,23〕，Bcl-2家族是同源編碼蛋白的大基因家族，在細胞凋亡信號轉導通路中起關鍵作用，決定著細胞是否進入凋亡通路，其包括抑制凋亡的Bcl-2及促進細胞凋亡的Bax等〔24〕。Caspase家族是哺乳動物細胞凋亡的啟動者和執行者，Caspase-3和Caspase-8則是細胞凋亡過程中的兩個重要蛋白。Caspase-3是重要的凋亡啟動蛋白，可通過多種途徑促使細胞核、細胞質及細胞骨架等參與凋亡所必需的重要蛋白質降解失活，Caspase-8作為關鍵的凋亡執行蛋白,在激活后可對細胞的凋亡起到一定的促進作用〔25〕。本實驗結果顯示，Ten能上調抗凋亡基因Bcl-2的表達，下調促凋亡基因Bax的表達，并且抑制Caspase-3與Caspase-8表達及活性。即Ten對Aβ誘導的Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8的異常表達有調控作用，能減少細胞的非正常性死亡，從而發揮對神經細胞的保護作用。

Ten作為傳統醫學治療神經系統疾病的重要藥物，具有益智、抗癡呆作用，大量研究表明，Ten可改善AD小鼠認知功能和學習記憶能力〔26～29〕，提高細胞抗氧化應激能力〔30〕，減少Aβ分泌及沉積，抑制神經細胞凋亡，從而發揮神經保護作用。但其作用機制還有待研究。本研究表明，Ten對Aβ誘導的神經細胞損傷及凋亡具有很好的保護作用，其機制可能是通過加快Aβ的轉運清除，減少細胞內Aβ的沉積，阻滯神經細胞周期的再活化而導致的神經細胞凋亡過程。本結果為Ten多靶點抗AD藥物的研究提供了實驗依據。