蝦青素預處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細胞損傷的機制

張露 趙芳 楊萬舉 項奕

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院眼科，湖北 武漢 430030)

糖尿病白內障的發生與晶狀體上皮細胞損傷有關，高血糖條件下，晶狀體上皮細胞發生氧化損傷和細胞凋亡，導致晶狀體上皮細胞功能缺失〔1,2〕。蝦青素是一種萜烯類化合物，屬于類胡蘿卜素，蝦青素在自然界內廣泛分布，有清除氧自由基、抗衰老、提高免疫力、抗腫瘤等作用〔3〕。蝦青素有保護視力的作用，其可改善視網膜損傷，蝦青素預處理減少視網膜色素上皮細胞氧化損傷〔4〕。研究表明，蝦青素能保護晶狀體上皮細胞損傷，其可抑制紫外線誘導的晶狀體上皮細胞凋亡〔5〕。蝦青素處理后，高糖條件下腎小管上皮細胞氧化損傷和細胞凋亡水平均下降〔6〕。現階段對蝦青素在高糖條件下晶狀體上皮細胞損傷中的作用還不明確。本研究探討蝦青素預處理對糖尿病晶狀體上皮細胞損傷的作用和機制。

1 材料與方法

1.1材料 蝦青素購自北京索萊寶科技有限公司；Notch1抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)抗體、Notch1受體胞內結合域(NICD)1抗體購自美國Invitrogen；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Bcl-2抗體、發狀分裂相關增強子(Hes)1抗體購自碧云天生物技術有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量檢測試劑盒購自上海超研生物科技有限公司；過氧化氫酶(CAT)含量檢測試劑盒購自上海古朵生物科技有限公司；人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)購自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2實驗分組 晶狀體上皮細胞用含有100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM培養，培養液中添加10%的胎牛血清，培養條件為：37℃，5% CO2培養箱。晶狀體上皮細胞共分成5組：(1)對照組：正常培養；(2)HG組：在實驗0 h時以30 mmol/L〔2〕的葡萄糖細胞培養液培養；(3)實驗-L組：在實驗開始前24 h，以4 μg/L的蝦青素細胞培養液培養預處理，然后在實驗0 h時，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續培養；(4)實驗-M組：在實驗開始前24 h，以8 μg/L的蝦青素細胞培養液培養預處理，然后在實驗0 h時，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續培養；(5)實驗-H組：在實驗開始前24 h，以16 μg/L的蝦青素細胞培養液培養預處理，然后在實驗0 h時，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續培養。

1.3CCK-8測定細胞增殖 晶狀體上皮細胞分別按照每孔中添加3 000個細胞接種到96孔板內，然后按照各組分組方法處理培養，培養24 h后，將培養板從培養箱內取出，添加CCK-8溶液各10 μl，在酶標儀上測定450 nm的A值，A值越大，細胞增殖活性越強。

1.4流式細胞術測定凋亡 收集各組培養24 h后的細胞，在細胞內添加磷酸鹽緩沖液(PBS)，1 000 r/min離心10 min，將上清溶液棄掉，在細胞內分別添加300 μl的結合緩沖液，充分混合以后，分別添加10 μl的碘化丙啶(PI)和5 μl的Annexin V-FITC溶液，置于避光條件下結合15 min，以流式細胞儀測定細胞凋亡變化。

1.5檢測細胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平 收集各組培養24 h后的細胞，以MDA含量檢測試劑盒、SOD含量檢測試劑盒、GSH-Px含量檢測試劑盒、CAT含量檢測試劑盒測定MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平，步驟同試劑盒說明書。

1.6Western印跡檢測Bax、Bcl-2、Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達 收集各組培養24 h后的細胞，用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取各組細胞總蛋白，蛋白濃度檢測按照常規二喹啉甲酸(BCA)法測定。在蛋白樣品內添加2×上樣緩沖液，充分混合，放在100℃中反應5 min。本次實驗采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每個孔內蛋白樣品的上樣量為40 μg，首先以90 V的電壓在濃縮膠中電泳，然后以100 V的電壓在分離膠中電泳，電泳結束以后，取出凝膠，在4℃條件下，以60 V的電壓進行轉膜。轉膜結束以后，將NC膜取出，放在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫結合2 h，然后將NC膜放在含有稀釋后的一抗溶液中，在4℃環境中過夜，最后將NC膜放在含有1∶2 000稀釋的二抗溶液中，在室溫中結合2 h。電化學(ECL)發光法顯色，內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，分析目的蛋白表達變化。Bax、Bcl-2、Notch1、NICD1、Hes1一抗分別按照1∶600、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶1 000稀釋。

1.7Notch信號激活劑對蝦青素影響細胞增殖、凋亡和MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平作用 晶狀體上皮細胞在實驗開始前24 h，以8 μg/L的蝦青素和500 μg/L的Notch信號激活劑Jagged1細胞培養液培養預處理，然后在實驗0 h時，添加30 mmol/L的葡萄糖繼續培養，記為實驗-M+Jagged1組，以實驗-M組作為參照，分析細胞增殖(CCK-8法步驟同1.3)、凋亡(流式細胞術步驟同1.4)和Bax、Bcl-2、Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達(Western印跡步驟同1.6)及MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平(步驟同1.5)。

1.8造模及分組 按照參考文獻〔1〕造模方法制備白內障小鼠模型， 蝦青素組小鼠在造模的同時給予蝦青素灌胃，灌胃劑量為0.24 g/kg，每天灌胃1次，直到造模結束。取小鼠晶狀體組織，檢測晶狀體混濁程度。晶狀體混濁程度評分標注參照文獻〔1〕。對照組和蝦青素組每組9只小鼠。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1蝦青素預處理對高糖作用下晶狀體上皮細胞增殖影響 0、4、8、16 μg/L蝦青素處理后的晶狀體上皮細胞增殖活性(0.66±0.05、0.63±0.05、0.64±0.07、0.62±0.06)差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組晶狀體上皮細胞增殖活性(0.67±0.05)比較，HG組(0.25±0.03)顯著下降(P<0.05)；與HG組比較，實驗-L、實驗-M、實驗-H組晶狀體上皮細胞增殖活性(0.35±0.04、0.49±0.05、0.62±0.06)依次升高(P<0.05)。表明蝦青素預處理提高高糖作用下晶狀體上皮細胞增殖活性。

2.2蝦青素預處理對高糖作用下晶狀體上皮細胞凋亡影響 與對照組比較，HG組晶狀體上皮細胞凋亡率顯著升高，細胞中Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)；與HG組比較，實驗-L、實驗-M、實驗-H組晶狀體上皮細胞凋亡率逐漸降低，細胞中Bax蛋白表達水平逐漸降低，Bcl-2蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表1，表明蝦青素預處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細胞凋亡。

圖1 流式細胞術檢測凋亡

圖2 Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達

表1 蝦青素預處理后高糖作用下晶狀體上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

2.3蝦青素預處理對高糖作用下晶狀體上皮細胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平影響 與對照組比較，HG組晶狀體上皮細胞MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著下降(P<0.05)；與HG組比較，實驗-L、實驗-M、實驗-H組晶狀體上皮細胞MDA水平逐漸降低，SOD、GSH-Px、CAT水平逐漸升高(P<0.05)。見表2。表明蝦青素預處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細胞氧化損傷。

2.4蝦青素預處理對高糖作用下晶狀體上皮細胞中Notch信號通路影響 與對照組比較，HG組晶狀體上皮細胞Notch1、NICD1、Hes1水平顯著升高(P<0.05)；與HG組比較，實驗-L、實驗-M、實驗-H組晶狀體上皮細胞Notch1、NICD1、Hes1水平逐漸降低(P<0.05)。見表2、圖3，表明蝦青素預處理抑制高糖作用下晶狀體上皮細胞中Notch信號通路激活。

表2 蝦青素預處理后高糖作用下晶狀體上皮細胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT、Notch1、NICD1、Hes1水平

圖3 Western印跡檢測蝦青素處理后高糖作用下晶狀體上皮細胞中Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達

2.5Notch信號通路激活劑對蝦青素預處理影響高糖作用下晶狀體上皮細胞中Notch信號通路作用 與實驗-M組比較，實驗-M+Jagged1組晶狀體上皮細胞Notch1、NICD1、Hes1水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達

表3 Notch信號激活劑和蝦青素預處理后高糖作用下晶狀體上皮細胞中Notch1、NICD1、Hes1蛋白水平

2.6Notch信號通路激活劑對蝦青素預處理影響高糖作用下晶狀體上皮細胞增殖、凋亡和MDA、SOD、GSH-Px、CAT作用 與實驗-M組比較，實驗-M+Jagged1組晶狀體上皮細胞增殖活性顯著降低，凋亡率顯著升高，Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著下降(P<0.05)。見圖5、表4。

圖5 檢測Notch信號激活劑對蝦青素預處理影響高糖作用下晶狀體上皮細胞凋亡和Bax、Bcl-2蛋白表達

表4 Notch信號激活劑和蝦青素預處理后高糖作用下晶狀體上皮細胞增殖活性、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平及MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平

2.7蝦青素對糖尿病白內障小鼠晶狀體混濁程度的影響 對照組晶狀體混濁程度Ⅰ度9例，Ⅱ、Ⅲ度均0例，蝦青素組Ⅰ度6例，Ⅱ度3例，Ⅲ度均0例。兩組糖尿病白內障小鼠晶狀體混濁程度嚴重，且蝦青素組晶狀體混濁程度較對照組明顯減弱。

3 討 論

糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢，糖尿病患者病程較長，長期的高血糖可誘導多種并發癥發生，糖尿病白內障是糖尿病引起常見的眼部疾病〔7〕。晶狀體上皮細胞是糖尿病白內障的重要靶細胞，其在高糖刺激下發生氧化損傷和細胞凋亡，這也是目前發現的糖尿病白內障發病機制之一〔8〕。正常情況下，存在于機體內的抗氧化系統和氧化系統處于動態平衡狀態，而當抗氧化酶活性下降，而機體內氧自由基不斷產生時，細胞內過量的氧自由基可誘導脂質發生過氧化，造成細胞損傷〔9〕。SOD、GSH-Px、CAT是存在于機體內的抗氧化酶，其活性下降可誘導氧化損傷〔10〕。MDA是脂質過氧化的產物，其表達水平異常升高是氧化損傷的標志之一〔11〕。研究表明，細胞內過量的氧自由基可誘導細胞凋亡，促進細胞損傷發生〔12〕。Bcl-2蛋白家族是與細胞凋亡關系密切的調控因子，其含有多個成員，分別在細胞凋亡進展中發揮促進和抑制作用，Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中的抑凋亡蛋白〔13〕。本研究結果提示高糖誘導晶狀體上皮細胞損傷，說明構建了晶狀體上皮細胞損傷模型。

蝦青素是一種從藻類、真菌、蝦蟹外殼中提取出來的紅色類胡蘿卜素，其有降低血壓、保護神經系統、延緩衰老、保護視力、增加免疫力等功效〔14〕。研究發現，蝦青素能抑制紫外線誘導的晶狀體上皮細胞損傷〔5〕。蝦青素還能改善糖尿病大鼠血管內皮功能障礙，減少血管氧化損傷〔15〕。蝦青素預處理后的糖尿病腎小管上皮細胞凋亡水平下降〔6〕。蝦青素能預防糖尿病白內障發生〔16〕。本研究結果提示蝦青素預處理能通過抑制細胞凋亡和氧化損傷發揮抗糖尿病白內障作用。

Notch是一個高度保守的信號通路，由跨細胞膜配體、受體及下游信號等組成，Notch1是Notch信號的受體之一，Hes1是Notch的下游效應因子，NICD1是Notch信號活化后的形式〔17,18〕。Notch信號有調控細胞增殖、分化、凋亡及氧化應激等作用〔19,20〕。研究顯示，Notch與糖尿病并發癥有關，在糖尿病腎病發生過程中，人們發現Notch信號病理性激活，影響腎纖維化、足細胞損傷發生〔21～23〕。研究表明，Notch在高糖誘導的晶狀體上皮細胞中過度激活，并且抑制Notch信號可減少高糖誘導的晶狀體上皮細胞損傷〔24〕。本研究結果說明蝦青素作用機制可能與Notch信號有關。激活Notch信號可逆轉蝦青素預處理對高糖條件下晶狀體上皮細胞凋亡和氧化應激的抑制作用，充分證實蝦青素作用機制與Notch信號有關。

綜上，蝦青素預處理能改善高糖誘導的晶狀體上皮細胞損傷，減少細胞凋亡和氧化損傷，機制與抑制Notch信號有關，蝦青素可能是預防和治療糖尿病白內障的途徑之一。