氧化苦參堿對高果糖喂養(yǎng)小鼠脂肪肝及肝氧化應(yīng)激的干預(yù)作用

章冬梅 呂秀芹 于賢 劉娜 劉可 宋光耀 陳樹春 任路平

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050000)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)在一般人群中發(fā)病率為17%～33%〔1〕，NAFLD治療是目前的研究熱點。飲食因素是誘發(fā)NAFLD的重要因素之一，研究表明果糖過量攝入也是引起NAFLD的重要飲食因素〔2〕。氧化苦參堿具有調(diào)節(jié)血脂、抗脂質(zhì)過氧化、抗感染、抗腫瘤等多種藥理作用〔3〕。但目前尚缺少關(guān)于氧化苦參堿對脂肪肝內(nèi)氧化應(yīng)激影響的研究，故本研究通過果糖過量攝入誘導(dǎo)小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，探討氧化苦參堿對脂肪肝和肝氧化應(yīng)激的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：選取成年雄性C57BL/J6小鼠各36只，體重24～30 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按隨機數(shù)字表分為對照組、高果糖組和氧化苦參堿組。對照組給予普通飼料；果糖組飼料配方為：果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9.0%，蛋白21.0%(配方參考研究〔4〕)；氧化苦參堿組喂養(yǎng)4 w后給予藥物干預(yù)(苦參素膠囊，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司)，給藥劑量為40 mg/kg；3組每日進食熱量基本相等，喂養(yǎng)8 w。

1.2基本生化指標測定 喂養(yǎng)8 w后給予小鼠禁食10 h，于鼠尾取血，分離血清，全自動生化分析儀測定空腹血糖(FPG)和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，用放射免疫法測定空腹胰島素(FINS)。

1.3肝組織三酰甘油(TG)測定 切取30 mg凍存的小鼠肝組織，加入裂解液1 ml，碾磨組織，勻漿后靜置使組織充分裂解，以抽提TG，應(yīng)用0.6%氯化鈉(NaCl)分離水相和有機相，吸取有機相并溶解于100%乙醇500 μl，應(yīng)用GPO-PAP試劑盒測定TG含量。

1.4肝臟氧化應(yīng)激指標檢測 應(yīng)用電動組織研磨儀將肝臟組織破碎并勻漿，15 000 r/min離心15 min后取上清，測定肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及細胞中丙二醛(MDA)含量，上述試劑均購于南京建成生物工程研究所。

1.5小鼠肝臟抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子蛋白檢測 各組隨機選6例樣本，Western印跡測定小鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)因子蛋白表達。具體方法：取小鼠肝臟組織勻漿，應(yīng)用10倍裂解液提取肝臟組織中總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測肝臟樣本蛋白含量。每個樣本取20 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育(4°C搖床過夜)→二抗孵育(β-actin)→電化學(xué)(ECL)發(fā)光→顯影→定影；用Image J軟件分析，得出樣本的目的蛋白相對含量。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-E2相關(guān)因子(NRF)2、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，細胞色素P450家族(CYP)2E1抗體購自中國Boster，CYP4A蛋白購自美國Abcam。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1喂養(yǎng)8 w后各組基本指標水平比較 喂養(yǎng)8 w后，與對照組比較，高果糖組體重、FPG、FINS水平均顯著上升(P<0.05)，與高果糖組比較，氧化苦參堿組體重、FPG、FINS水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2喂養(yǎng)8 w后各組肝臟相關(guān)指標水平比較 喂養(yǎng)8 w后，與對照組比較，高果糖組ALT、TG水平均顯著上升(P<0.05)，與高果糖組比較，氧化苦參堿組ALT、TG水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組肝臟SOD、CAT、MDA水平比較 與對照組比較，高果糖組SOD、CAT水平均顯著下降(P<0.05)，與高果糖組比較，氧化苦參堿組SOD、CAT水平均顯著上升(P<0.05)；與對照組比較，高果糖組MDA水平均顯著上升(P<0.05)，與高果糖組比較，氧化苦參堿組MDA水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組基本指標及肝臟相關(guān)指標、SOD、CAT 水平及 MDA含量水平比較

2.4各組肝臟抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白水平比較 與對照組比較，高果糖組NRF2水平均顯著下降(P<0.05)，與高果糖組比較，氧化苦參堿組NRF2水平均顯著上升(P<0.05)；與對照組比較，高果糖組CYP2E1、CYP4A水平均顯著上升(P<0.05)，與高果糖組比較，氧化苦參堿組CYP2E1、CYP4A水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組肝臟抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達

表2 各組肝臟抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白水平比較

3 討 論

NAFLD發(fā)生率逐年升高，NAFLD是無癥狀A(yù)LT升高的最主要原因。研究發(fā)現(xiàn)富含高果糖的軟飲料大量攝入與NAFLD的發(fā)生有密切關(guān)系，果糖可刺激肝臟脂質(zhì)從頭合成而引起脂肪肝。高果糖喂養(yǎng)嚙齒類動物1 w即表現(xiàn)肝細胞內(nèi)脂肪增加，Armutcu等〔5〕給予雄性Wistar大鼠飼以10%果糖水，10 d后肝臟病理顯示微泡性及大泡性脂肪變。NAFLD的發(fā)生分為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化及肝癌4個階段，多數(shù)患者長期停留于單純性脂肪肝階段，而氧化應(yīng)激是介導(dǎo)已經(jīng)發(fā)生脂肪變性的肝細胞進一步發(fā)生炎癥的重要機制〔6〕。氧化應(yīng)激是指活性氧簇及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生過多，超過機體對其防御能力，出現(xiàn)促氧化物和抗氧化物之間的失平衡狀態(tài)。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，促進脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成和多種細胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1等介導(dǎo)炎性反應(yīng)，肝細胞發(fā)生炎癥、壞死，肝臟出現(xiàn)纖維化反應(yīng)〔7〕。肝臟抗氧化防御體系主要由抗氧化酶類系統(tǒng)構(gòu)成，包括CAT和SOD等多種酶類，MDA是活性氧簇對生物膜氧化的主要產(chǎn)物，MDA的大量產(chǎn)生代表著機體抗氧化能力的下降和氧化應(yīng)激。本研究提示，果糖過量攝入引起了小鼠肝臟抗氧化防御功能的減弱和氧化應(yīng)激產(chǎn)物的增加。Nrf2是與氧化應(yīng)激相關(guān)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，對很多抗氧化應(yīng)激因子的基因有調(diào)控作用〔8〕。CYP2E1 和CYP4A是負責(zé)機體氧自由基產(chǎn)生的重要酶類，也是誘導(dǎo)野生型小鼠脂肪肝的重要因子〔9〕，研究發(fā)現(xiàn)NAFLD嚙齒類動物和人類肝內(nèi)CYP2E1 和CYP4A的活性和表達均顯著升高，并且和脂質(zhì)過氧化相關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果提示果糖過量攝入通過促進肝臟CYP2E1和CYP4A的蛋白表達增加，造成了氧自由基的增加，引起了肝臟氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。

氧化苦參堿是自苦豆子及苦參根中提取的小分子化學(xué)物質(zhì)，具有逆轉(zhuǎn)各種原因?qū)е碌母螕p傷，臨床上主要應(yīng)用于慢性病毒性肝炎的治療。研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可下調(diào)高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的大鼠肝內(nèi)脂質(zhì)從頭合成，從而改善脂肪肝，氧化苦參堿可降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c的基因表達，下調(diào)脂質(zhì)從頭合成關(guān)鍵酶脂肪酸合成酶(FAS)，并上調(diào)線粒體棕櫚基轉(zhuǎn)移酶(CPT)-1的表達，從而通過抑制脂質(zhì)合成和促進線粒體的脂肪酸氧化改善肝內(nèi)脂質(zhì)沉積〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善肝臟脂質(zhì)沉積，氧化苦參堿可改善嚙齒類動物NAFLD模型的肝內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激非折疊蛋白反應(yīng)的上游蛋白如胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需要酶(IRE)-1的磷酸化和活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)-6的蛋白表達〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可通過改善氧化應(yīng)激對腦、心臟、肝臟、胃腸道、血管內(nèi)皮等多種器官和組織發(fā)揮保護作用〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可通過激活NRF2通路改善氧化應(yīng)激，從而治療脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷〔14〕。本研究結(jié)果提示氧化苦參堿對NAFLD的保護作用與改善肝臟不平衡的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，氧化苦參堿通過改善氧化應(yīng)激可逆轉(zhuǎn)高果糖飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD的病程進展。