柴胡皂苷A對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路及腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

高飛 徐琪 林怡 張杰偉

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 ?？?570100)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)以結(jié)腸潰瘍糜爛為主要特點(diǎn)，與遺傳、感染、環(huán)境等多因素有關(guān)〔1〕；且久治不愈，病情反復(fù)，具有癌變傾向并伴隨多種復(fù)雜腸外表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者生活和工作〔2〕。腸道上皮細(xì)胞通透性增加和免疫炎癥是主要致病因素，且腸上皮細(xì)胞凋亡可能在這一病因中發(fā)揮重要作用〔3〕。柴胡皂苷(SS)A具有強(qiáng)抗炎活性，主要通過(guò)抑制核因子(NF)-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎特性，進(jìn)而緩解炎癥類疾病〔4〕。而在NF-κB抑制物激酶(IKK)/抑制因子κB(IKB)/NF-κB信號(hào)通路中抑制IKKα/NF-κB途徑可抑制促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2基因相關(guān)X蛋白(Bax)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的表達(dá)、增加抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)的表達(dá)從而發(fā)揮抗凋亡作用〔5〕。推測(cè)SSA在UC中影響IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路及腸上皮細(xì)胞凋亡。因此，構(gòu)建UC模型，SSA處理后觀察對(duì)UC大鼠的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)、健康SD大鼠60只均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0009，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2018-0047，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：HG2019131476。所有動(dòng)物均在溫度24.5℃左右、濕度50%左右、12 h光照12 h黑暗條件下飼養(yǎng)，正常攝食飲食，且定期通風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，批號(hào)：556974)；SSA(原料藥，純度99%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20736-09-8)；柳氮磺吡啶(SASP)腸溶片(上海中西三維藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.25g/片，批號(hào)：20191213)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(碧云天生物科技有限公司，批號(hào)分別為：C0105、C1086、SF1127)；大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)分別為：SBJR0546、SBJR0311、SBJR1937)；一抗IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH抗體(英國(guó)abcam公司，批號(hào)分別為：ab197742、ab234570、ab100785、ab32041、ab32518、ab207297、ab13847)；羊抗鼠二抗(上海中科英沐生物科技有限公司，批號(hào)：PB004F6)。顯微鏡(日本尼康公司，型號(hào)：LV100ND型)；凝膠電泳儀(北京金時(shí)速儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：DYCP-44N型)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：GelDoc 2000)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模 根據(jù)參考文獻(xiàn)〔6〕方法制備UC大鼠模型，50只大鼠麻醉后，一次性將100 mg/kg TNBS和50%乙醇混合物0.25 ml經(jīng)14號(hào)導(dǎo)尿管緩慢注射入肛門8 cm左右深的腸腔內(nèi)，捏緊肛門并倒置數(shù)分鐘。造模后隨機(jī)分為模型組、SSA(低、中、高)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。正常組10只大鼠相同方法注射等體積生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)2 d。第3天時(shí)SSA(低、中、高)劑量組分別灌胃(12.5、25.0、50.0)mg/kg SSA〔7〕，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃0.5 g/kg SASP〔8〕，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)5 d。

1.2.2收集樣本 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠大便，毛色情況。結(jié)束后立即尾靜脈采血；處死大鼠取腸黏膜組織，部分置于4%多聚甲醛固定，部分置于-80℃冰箱待用。

1.2.3HE染色觀察腸黏膜組織形態(tài) 腸道經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明后包埋切片(厚度6 μm)，部分經(jīng)蘇木素染色、伊紅復(fù)染后顯微鏡下觀察腸黏膜組織形態(tài)。

1.2.4ELISA檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平 尾靜脈血室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清，大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.5TUNEL染色觀察腸上皮細(xì)胞凋亡情況 取1.2.3切片，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)腸上皮細(xì)胞凋亡情況，顯微鏡下可見(jiàn)凋亡腸上皮細(xì)胞熒光顯綠色，正常腸上皮細(xì)胞細(xì)胞核DAPI染色熒光顯藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6Western印跡檢測(cè)腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平 -80℃冰箱中取部分腸組織約30 mg，手術(shù)剪剪碎組織，每管加1 ml蛋白裂解液冰上研磨并裂解，4℃、13 400 r/min離心20 min，上清液即為腸組織總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH(稀釋比均為1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，第二天加入羊抗鼠二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1SSA對(duì)大鼠行為學(xué)影響 正常組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后毛色有光澤，大便正常；模型組大鼠毛色暗淡無(wú)光澤，大便出現(xiàn)不同程度的便血現(xiàn)象，便稀且黏；SSA 低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠毛色較暗淡，大便出現(xiàn)不同程度的緩和。

2.2SSA對(duì)腸黏膜組織的影響 正常組腸黏膜組織完整，肌層結(jié)構(gòu)正常；模型組腸黏膜處出現(xiàn)明顯炎癥現(xiàn)象，細(xì)胞排列紊亂，部分結(jié)腸腺體被浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞替代，黏膜層變?。籗SA 低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)不同程度的炎癥浸潤(rùn)和腸腺潰瘍現(xiàn)象，但較模型組有所降低。見(jiàn)圖1。

2.3SSA對(duì)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 與正常組相比，模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，SSA 低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；隨著SSA給藥劑量的增加，SSA各劑量組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平逐漸降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。見(jiàn)表1。

圖1 各組腸黏膜組織形態(tài)學(xué)情況(HE染色，×200)

表1 6組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4SSA對(duì)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響 與正常組相比，模型組腸上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，SSA 低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組腸上皮細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；隨著SSA給藥劑量的增加，SSA各劑量組腸上皮細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。見(jiàn)表1、圖2。

2.5SSA對(duì)腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平的影響 與正常組相比，模型組腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bax水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(均P<0.05)；與模型組相比，SSA 低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高(均P<0.05)；隨著SSA給藥劑量的增加，SSA各劑量組腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bax蛋白水平逐漸降低，Bcl-2蛋白水平逐漸升高(均P<0.05)，呈劑量依賴性。見(jiàn)表2、圖3。

圖2 6組腸上皮細(xì)胞凋亡情況(×200)

表2 6組腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平比較

A～F：正常組、模型組、SSA低劑量組、SSA中劑量組、SSA高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組圖3 各組腸黏膜組織中IKKα、IKB、NF-κB p65、caspase-3、Bcl-2、Bax Western印跡

3 討 論

中醫(yī)《皇帝內(nèi)經(jīng)》中將UC歸為“腸癖”“大癖泄”“久痢”“下痢”“泄瀉”“休息痢”等范疇，發(fā)病與情志所傷、飲食不節(jié)制不規(guī)律、脾胃虛弱等因素有關(guān)，目前尚未明確特效藥〔9〕。西醫(yī)治療UC，輕者較長(zhǎng)時(shí)間使用水楊酸劑、重者使用激素甚至免疫抑制劑，緩解后仍需使用較長(zhǎng)時(shí)間的水楊酸制劑，造成復(fù)發(fā)率高且存在較多的不良反應(yīng)〔10〕。柴胡最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，具有疏肝解郁、保肝利膽、降溫抗癌等功效，有效成分SSA具有抑制炎癥因子作用〔11〕；亦能夠通過(guò)信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖從而影響凋亡〔12〕。本研究提示UC大鼠腸道出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致大鼠腸道吸收受到影響，影響大鼠毛色和大便狀態(tài)。SSA可以改善腸黏膜組織癥狀，減少炎癥現(xiàn)象，從而緩解疾病。

IL-1可由單核、巨噬、中性粒、內(nèi)皮細(xì)胞分泌，包括IL-1α、IL-1β，IL-1β可趨化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入腸道病變組織，誘發(fā)腸道炎癥和腸道組織破壞〔13〕。IL-6主要由巨噬、淋巴、內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附因子的極化，而細(xì)胞間黏附因子是UC中中性粒細(xì)胞-上皮細(xì)胞間相互作用的重要黏附顆粒〔14〕。TNF-α是由細(xì)菌脂多糖激活單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的分泌，促進(jìn)嗜酸性、嗜堿性細(xì)胞的分泌；可改變腸上皮細(xì)胞形態(tài)和屏障功能，誘導(dǎo)腸上皮黏膜通透性改變〔15〕。本研究與Zhu等〔16〕研究結(jié)果類似，提示IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子在UC中處于激活狀態(tài)，可刺激中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等的分泌，加重腸道損傷；促進(jìn)信號(hào)通路表達(dá)，引發(fā)腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。本研究提示SSA可抑制炎癥因子的表達(dá)，從而緩解疾病。

NF-κB作為重要的基因轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔17〕。IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路中IKKα控制NF-κB p65的磷酸化過(guò)程從而影響DNA結(jié)合活性，同時(shí)IKKα過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)TNF-α的反應(yīng)，即NF-κB的凋亡和活化過(guò)程〔18，19〕。而Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡的關(guān)鍵蛋白，Bcl-2主要調(diào)控凋亡途徑的阻斷過(guò)程，可阻斷、抑制細(xì)胞凋亡；Bax可拮抗Bcl-2，發(fā)揮促凋亡作用〔20〕。caspase-3在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)執(zhí)行中發(fā)揮核心地位，是細(xì)胞凋亡的主要反映因子，是多種細(xì)胞凋亡信息傳遞的匯聚點(diǎn)〔21〕。本研究提示SSA可抑制IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路從而抑制炎癥因子水平，對(duì)凋亡基因的促進(jìn)作用減弱，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)UC大鼠的保護(hù)。